Frontiers | Standardization of Sequencing Coverage in NGS: Recommendation for Detection of Clonal and Subclonal Mutations in Cancer Diagnostics/Oncology

wstęp

next-generation sequencing (NGS) has rapidly expended into the clinical setting in hemato-oncology and oncology, as it may bring great benefits for diagnosis, selection of treatment, and / or prognostication for many patients (1)., Ostatnio opublikowano kilka artykułów na temat walidacji głęboko ukierunkowanych NGS w onkologii klinicznej( 2, 3), w tym kompleksową rekomendację przez Association for Molecular Pathology i College of American Patologists (1). Jednak brak standaryzacji ukierunkowanych metod NGS nadal ogranicza ich wdrażanie w praktyce klinicznej (4).

jednym z wyzwań w szczególności jest prawidłowe wykrywanie mutacji obecnych w niskich częstotliwościach alleli wariantowych (VAF) i standaryzacja głębokości pokrycia sekwencjonowania (1, 5, 6)., Jest to szczególnie ważne w przypadku mutacji, które mają wpływ kliniczny na częstotliwości subklonalne (1), takich jak przypadek mutacji genu TP53 (tp53mut) w przewlekłej białaczce limfocytowej (CLL) (7, 8). Aberracje TP53 (tp53mut i / lub delecja chromosomu 17P) są jednymi z najsilniejszych markerów prognostycznych i prognostycznych kierujących decyzjami leczenia w PBL (9)., Obecnie Europejska inicjatywa badawcza nad przewlekłą białaczką limfocytową (ERIC) zaleca wykrywanie TP53mut z limitem wykrywalności (LOD) wynoszącym co najmniej 10% VAF (10), a istnieje coraz więcej dowodów poświęconych wpływowi klinicznemu małych zmutowanych podklon TP53 w PBL (7, 8).

sekwencjonowanie Sangera i głęboko ukierunkowane NGS są obecnie najczęściej używanymi technikami do analizy TP53mut (10), a także do analizy innych genów o oddziaływaniu klinicznym przy niskich częstotliwościach alleli., Chociaż sekwencjonowanie Sangera zapewnia stosunkowo przystępne podejście do sekwencjonowania, brakuje czułości potrzebnej do wykrywania podklonów ze względu na jego granicę wykrywania 10-20% zmutowanych alleli (10). Analiza oparta na NGS zyskała zatem znaczenie w laboratoriach diagnostycznych do wykrywania wariantów somatycznych i opracowywane są różne techniczne osiągnięcia strategii korekcji błędów, zarówno obliczeniowych, jak i eksperymentalnych, w celu dokładnej identyfikacji niskopoziomowych zmian genetycznych (11)., Dlatego zwracamy uwagę na znaczenie prawidłowego określania głębokości sekwencjonowania w diagnostycznych NGS w celu uzyskania pewnego i powtarzalnego wykrywania, nie tylko wariantów o niskim VAF. Na koniec przeprowadziliśmy eksperyment rozcieńczania, aby potwierdzić nasze obliczenia teoretyczne, a na zakończenie omówimy nasze doświadczenia z diagnostycznym wykrywaniem TP53mut u pacjentów z PBL oraz dalsze perspektywy standaryzacji NGS w diagnostyce nowotworów.,

głębokość sekwencjonowania NGS i poziom błędu

głębokość sekwencjonowania NGS bezpośrednio wpływa na odtwarzalność detekcji wariantu: im większa liczba odczytów wyrównanych sekwencji, tym większa pewność wywołania bazowego w określonej pozycji, niezależnie od tego, czy wywołanie bazowe jest takie samo jak Baza odniesienia, czy jest zmutowane (1). Innymi słowy, poszczególne odczyty błędów sekwencjonowania są statystycznie nieistotne, gdy mają przewagę liczebną nad prawidłowymi odczytami., W związku z tym pożądaną głębokość pokrycia należy określić na podstawie zamierzonego LOD, tolerancji wyników fałszywie dodatnich lub fałszywie ujemnych oraz poziomu błędu sekwencjonowania (1, 11).

korzystając z rozkładu dwumianowego można obliczyć prawdopodobieństwo fałszywie dodatnich i fałszywie ujemnych wyników dla danego poziomu błędu, jak również zamierzonego LOD, a także oszacować próg dla wariantu wywołującego daną głębokość (1)., Na przykład, biorąc pod uwagę poziom błędu sekwencjonowania wynoszący 1%, obciążenie zmutowanych alleli wynoszące 10% i głębokość pokrycia 250 odczytów, prawdopodobieństwo wykrycia 9 lub mniej zmutowanych odczytów wynosi, zgodnie z rozkładem dwumianowym, 0,01%. Stąd prawdopodobieństwo wykrycia 10 lub więcej mutowanych odczytów wynosi 99,99% (100-0, 01%) i można zdefiniować próg dla wywołania wariantu. Innymi słowy, głębokość pokrycia 250 z progiem co najmniej 10 zmutowanych odczytów będzie miała 99.,99% prawdopodobieństwa, że 10% zmutowanego allelu nie zostanie pominięte przez wywołanie wariantu (chociaż może być wykryte w innej proporcji). W ten sposób ryzyko fałszywie ujemnego wyniku jest znacznie zminimalizowane. Z drugiej strony, prawdopodobieństwo fałszywych alarmów w dużym stopniu zależy od błędu sekwencjonowania (ponieważ dokładność wszystkich pomiarów analitycznych zależy od stosunku sygnału do szumu) (1, 11). W naszym przykładzie prawdopodobieństwo fałszywie dodatniego wyniku wynosi 0,025%; jednak wskaźnik fałszywie dodatniego wyniku nie jest nieistotny przy zmniejszaniu LOD do wartości zbliżonej do poziomu błędu., Konwencjonalne wewnętrzne wskaźniki błędów NGS wahają się od 0,1 do 1% (wynik jakości Phred 20-30) (1, 11) w zależności od platformy sekwencjonowania, zawartości GC w regionach docelowych (12) i długości fragmentu, jak pokazano w sekwencjonowaniu w parach Illumina (13). Dlatego na wykrywanie wariantów w VAFs<2% ma wpływ wysokie ryzyko fałszywie dodatniego wyniku, niezależnie od głębokości pokrycia., Należy również wspomnieć, że poziom błędu sekwencjonowania ma zastosowanie tylko do błędów powstałych w wyniku samego sekwencjonowania i nie obejmuje innych błędów wprowadzonych podczas przetwarzania DNA i przygotowywania biblioteki, szczególnie podczas etapów amplifikacji, które dodatkowo zwiększają poziom błędu (1, 11).

minimalny zakres sekwencjonowania w warunkach klinicznych

obecnie nie ma konsensusu co do minimalnego wymaganego zakresu w warunkach klinicznych przy użyciu głębokiego resekwencjonowania ukierunkowanego przez NGS, a więc każde laboratorium musi ustawić własne parametry, aby osiągnąć wystarczającą jakość (1, 5)., Do tej pory tylko kilka badań zaleciło minimalne kryteria pokrycia dla głębokich celowanych NGS w onkologii klinicznej: głębokość pokrycia 500 i LOD 5% (2), głębokość pokrycia 300-500 bez przeciwstawienia się LOD (3), głębokość 250 i LOD 5% z regulacją progu do 1000 głębokości pokrycia jest wymagana w przypadkach heterogenicznych wariantów w próbkach o niskiej komórkowości nowotworu (1) i głębokość 100 z co najmniej 10 wariantami odczytów i LOD 10% (10).., Zgodnie z binominalnym rozkładem danych głębokość pokrycia 250 powinna być rzeczywiście wystarczająca do wykrycia 5% VAF przy progu wariantu obsługującego odczyty ≥5 (Rysunek 1). Z drugiej strony, analiza NGS o głębokości pokrycia wynoszącej 100 wraz z wymogiem co najmniej 10 wariantów potwierdzających odczyty, zgodnie z zaleceniami konsorcjum ERIC (10), dałaby fałszywie ujemny wynik w wysokości 45% W przypadku próbek o LOD wynoszącym 10%., Aby potwierdzić te obliczenia teoretyczne, przeprowadziliśmy dwa niezależne eksperymenty rozcieńczania w celu oszacowania wydajności analizy TP53 NGS w celu wykrycia 10% VAF na głębokości zasięgu 100 odczytów. Rzeczywiście, wykryliśmy 30% fałszywych negatywów (5 próbek pozytywnych z 7 próbek prawdziwych i 9 próbek pozytywnych z 13 próbek prawdziwych) w dwóch niezależnych seriach sekwencjonowania. Niestety, odsetek fałszywie ujemnych jest często niedoceniany w ukierunkowanej resekwencji., Ponadto, ostatnie badanie badające wyniki międzylaboratoryjne somatycznego wykrywania wariantu z VAFs między 15 a 50% W 111 laboratoriach ze zgłoszonymi LD 5-15% (6) pokazuje, że poważne błędy w diagnostycznych NGS mogą wynikać z fałszywie ujemnych wyników, nawet w próbkach z wysokim obciążeniem mutacji (6). Spośród trzech równoczesnych wyników fałszywie dodatnich wszystkie warianty zostały prawidłowo wykryte, ale błędnie zidentyfikowane (6)., Ponieważ laboratoria nie zostały poproszone o zgłaszanie głębokości zasięgu dla innych regionów niż zidentyfikowane warianty (6), możemy tylko założyć, że niski zasięg lub wysokie progi wywołania wariantu przyczyniły się do fałszywie ujemnych wyników. Wyniki te dodatkowo podkreślają potrzebę standaryzowanych parametrów głębokości pokrycia w diagnostycznych NGS, z uwzględnieniem błędów sekwencjonowania, a także błędów specyficznych dla testu.

rysunek 1

Rysunek 1. LOD jako funkcja głębokości pokrycia zgodnie z rozkładem dwumianowym., Głębokość pokrycia potrzebna do utrzymania zamierzonego LOD (w zakresie 3-20% VAF) dla trzech skumulowanych ustawień prawdopodobieństwa: dla fałszywie dodatniego prawdopodobieństwa 0,001 i prawdziwego dodatniego 0,999, LOD 20% osiąga się przy głębokości pokrycia 61, LOD 10% przy 175, LOD 5% przy 562 i LOD 3% przy 1650. Dla fałszywie dodatniego prawdopodobieństwa 0,010 i prawdziwego dodatniego 0,990, LOD 20% osiąga się przy 31, LOD 10% przy 81, LOD 5% przy 288 i LOD 3% przy głębokości pokrycia 886, odpowiednio. Dla fałszywie dodatniego prawdopodobieństwa 0,050 i prawdziwego dodatniego 0.,950, LOD 20% osiąga się przy 30, LOD 10% przy 30, LOD 5% przy 124 i LOD 3% przy głębokości pokrycia 392, odpowiednio.

częstość występowania mutacji Subklonalnych TP53 w PBL wykrywanych za pomocą diagnostycznych NGS

w celu oceny występowania niskiego VAF w rzeczywistych warunkach, dokonaliśmy przeglądu naszej kohorty pacjentów z PBL przebadanych pod kątem TP53mut w naszym laboratorium diagnostycznym. Tp53mut oceniono zgodnie z wcześniejszymi doniesieniami (14, 15). Krótko analizowano TP53 (egzony 2-10, w tym 2 bp intronic overlap, 5′ I 3 ' UTR) z użyciem 100 ng gDNA na reakcję., Biblioteki oparte na amplikonie zostały zsekwencjonowane jako sparowane na MiSeq (2×151, Illumina) o minimalnej docelowej głębokości odczytu 5000 x. LOD TP53mut ustawiono na 1% , A warianty w zakresie 1-3% potwierdzono replikacją. Pisemną świadomą zgodę uzyskano od wszystkich pacjentów, którzy zostali włączeni zgodnie z deklaracją Helsińską, a badanie zostało zatwierdzone przez lokalną Komisję Etyczną.

w kohorcie diagnostycznej 859 pacjentów z PBL (Kwiecień 2016–Kwiecień 2019), 25% (215/859) było dodatnich dla TP53mut, a 52,6% (113/215) nosiło warianty z VAF na poziomie 10% lub niższym., Zgodnie z naszymi obserwacjami, ostatnie badanie (8) wykazało obecność 63% I 84% małych obciążeń (Sanger ujemnych) TP53muts u pacjentów z PBL w momencie rozpoznania i w czasie leczenia oraz potwierdziło negatywny wpływ na całkowite przeżycie TP53muts powyżej 1% VAF w czasie leczenia (8).,

kalkulator do diagnostycznych ustawień NGS do wykrywania mutacji Subklonalnych

aby pomóc laboratoriom w określeniu minimalnych parametrów właściwego pokrycia, dostarczamy prosty, przyjazny dla użytkownika Kalkulator teoretyczny (oprogramowanie) oparty na rozkładzie dwumianowym (Rysunek 2), opisany w pliku dodatkowym. Aplikacja internetowa (lub desktopowa) i autonomiczne kody źródłowe w R są dostępne na Githubie: https://github.com/mvasinek/olgen-coverage-limit., Za pomocą tego kalkulatora, prawidłowe parametry głębokości sekwencjonowania i odpowiedniej minimalnej liczby odczytów wariantu dla danego poziomu błędu sekwencjonowania i zamierzonego LOD można łatwo określić. Ponadto użytkownicy mogą również wziąć pod uwagę inne błędy, po prostu dodając błędy specyficzne dla testu do sekwencjonowania poziomu błędu i używając tego ogólnego błędu jako danych wejściowych do kalkulatora. Na przykład, w naszym przypadku analizy mutacyjnej TP53 obliczyliśmy z ogólnym błędem ~1.16%, dlatego ustawiliśmy nasze minimalne wymagania dotyczące głębokości pokrycia na 2000 z progiem minimum 40 odczytów dla 3% VAF.,

rysunek 2

Rysunek 2. OLGEN Coverage Limit calculator-Prosty kalkulator teoretyczny odpowiedni do określenia prawidłowej głębokości sekwencjonowania i odpowiedniej minimalnej liczby odczytów wariantowych zgodnie z rozkładem dwumianowym dla danego stopnia błędu sekwencjonowania i zamierzonego LOD zalecanego do diagnostycznych NGS. Przykłady obliczonych głębokości sekwencjonowania i odpowiedniej minimalnej liczby odczytów wariantowych zalecanych dla wariantów z (a) 10% VAF i 99,9% prawdopodobieństwem wykrycia oraz (B) 3% VAF i 99,9% prawdopodobieństwem wykrycia.,

dyskusja

chociaż diagnostyczne NGS zyskały na znaczeniu w warunkach klinicznych w ocenie mutacji somatycznych w raku, niewystarczająca standaryzacja parametrów sekwencjonowania nadal ogranicza jego implementację w praktyce klinicznej (1), głównie dla wariantów występujących przy niskich częstotliwościach alleli (4). W związku z tym zajęliśmy się kwestią techniczną prawidłowego określania głębokości sekwencjonowania w diagnostycznych NGS w celu uzyskania pewnych i powtarzalnych wykrywań wariantów o niskim VAF., W szczególności wykonaliśmy obliczenia teoretyczne w celu określenia optymalnej głębokości pokrycia dla pożądanego prawdopodobieństwa wykrycia wariantów przy niskich częstotliwościach alleli, z uwzględnieniem błędu sekwencyjnego. Co więcej, potwierdziliśmy te teoretyczne obliczenia, przeprowadzając eksperymenty rozcieńczania. Na podstawie tych obserwacji, zalecamy głębokość pokrycia 1650 lub wyższą (wraz z odpowiednim progiem co najmniej 30 mutowanych odczytów), aby wywołać ≥3% wariantów w celu osiągnięcia 99,9% prawdopodobieństwa wykrycia wariantu, używając tylko konwencjonalnego błędu sekwencjonowania NGS., Warianty w zakresie VAF 1-3% można wywołać tylko wtedy, gdy Uzyskane dane sekwencyjne są wysokiej jakości (średnia Q30 > 90%) i/lub gdy warianty są potwierdzone replikacją lub metodą ortogonalną (1, 11, 16). Dostarczamy również prosty, przyjazny dla użytkownika Kalkulator teoretyczny (oprogramowanie), aby pomóc laboratoriom w rozwiązywaniu prawidłowej głębokości sekwencjonowania i odpowiedniej minimalnej liczby odczytów wariantu, biorąc pod uwagę poziom błędu sekwencjonowania. Nasz prosty kalkulator może pomóc zminimalizować fałszywie dodatnie i fałszywie ujemne wyniki w diagnostycznych NGS.,

Błędy mogą wystąpić na wielu etapach podczas przetwarzania DNA i przygotowywania biblioteki. Najczęściej spotykane są błędy amplifikacji wprowadzane podczas przygotowywania biblioteki NGS (1, 12, 17). Inne popularne źródła błędów mają do czynienia ze złożonością biblioteki (liczba niezależnych analizowanych cząsteczek DNA), jakością DNA i złożonością regionu docelowego itp. Wszystkie potencjalne błędy specyficzne dla testu należy rozwiązać za pomocą projektu badania, walidacji metody i kontroli jakości.,

obecnie opracowywane są nowe strategie korekcji błędów, zarówno obliczeniowe, jak i eksperymentalne, w celu złagodzenia wysokich wskaźników błędów w diagnostycznych NGS (11). Do tej pory wśród najbardziej obiecujących metod korekcji błędów należą UMI (Unique Molecular Identifiers), które korygują błędy PCR (18), oraz podejścia korekcji sygnału do szumu (11). Postępy te próbują zmniejszyć LOD, zwiększając w ten sposób dokładność sekwencjonowania potrzebną dla przyszłych możliwości w diagnostyce NGS.,

w celu poprawy standaryzacji w diagnostycznych NGS, oszacowanie prawidłowej głębokości pokrycia jest zalecanym punktem wyjścia przy ocenie progów otaczających konkretny test NGS. Niemniej jednak nadal brakuje opublikowanych wytycznych dotyczących minimalnych wymagań technicznych i ich raportowania w NGS, szczególnie ważnych w wykrywaniu mutacji klonalnych i subklonalnych w diagnostyce nowotworów., Wynika to głównie z szerokiego zakresu podejść do przygotowania biblioteki i licznych zmiennych odgrywających rolę w każdym konkretnym teście NGS, które są trudne do standaryzacji, wraz ze zmiennością międzylaboratoryjną. W związku z tym bardzo pożądane jest zdefiniowanie minimalnych wymagań technicznych i ich sprawozdawczość w NGS., W oparciu o nasze doświadczenie w diagnostyce NGS w hemato-onkologii, sugerujemy zgłaszanie co najmniej następujących parametrów technicznych: LOD, całkowity błąd testu NGS (lub co najmniej poziom błędu sekwencjonowania), ilość wejściowego DNA, źródło i jakość DNA, minimalna głębokość pokrycia i procent docelowych baz uporządkowanych na tej minimalnej głębokości, całkowita liczba odczytów docelowych obejmujących region wariantu i liczba odczytów wspierających wariant. Szczególny nacisk należy położyć na standaryzację NGS próbek formaliny osadzonej parafinowo (FFPE) (19, 20).,

biorąc pod uwagę, nasze badanie podkreśla znaczenie prawidłowej głębokości sekwencjonowania i minimalnej liczby odczytów wymaganych do niezawodnego i powtarzalnego wykrywania wariantów z niskim VAF w diagnostycznych NGS. Obliczanie prawidłowej głębokości sekwencjonowania dla danego poziomu błędu przy użyciu naszego przyjaznego dla użytkownika kalkulatora teoretycznego (oprogramowania) może pomóc zminimalizować fałszywie dodatnie i fałszywie ujemne wyniki w diagnostycznych NGS, w sytuacjach związanych z mutacjami subklonalnymi między innymi., Rygorystyczne testy i znormalizowane minimalne wymagania dotyczące diagnostycznych NGS są szczególnie pożądane, aby zapewnić prawidłowe wyniki w warunkach klinicznych.

dostępność danych

zbiory danych wygenerowane dla tego badania są dostępne na uzasadnione żądanie autora.

wkład autora

AP i EK zaprojektowali badanie, zinterpretowali wyniki i napisali rękopis. AP, LS, TD i PS przeprowadziły analizę NGS. TP zebrało próbki pacjentów i dane kliniczne. MV przeprowadził analizę bioinformatyczną i napisał kod kalkulatora. TN przygotowała aplikację internetową., Wszyscy autorzy przeczytali i zatwierdzili ostateczną wersję manuskryptu.

dofinansowanie

dofinansowanie: MZ CR VES16-32339a, częściowo przez MH CZ-DRO (FNOl, 00098892).

Oświadczenie o konflikcie interesów

autorzy oświadczają, że badanie zostało przeprowadzone w przypadku braku jakichkolwiek relacji handlowych lub finansowych, które mogłyby być interpretowane jako potencjalny konflikt interesów.

podziękowania

przepraszamy wielu autorów, których artykuły nie mogły być cytowane ze względu na ograniczenia odniesienia.,

Supplementary Material

1. Jennings LJ, Arcila ME, Corless C, Kamel-Reid S, Lubin IM, Pfeifer J, et al. Guidelines for validation of next-generation sequencing-based oncology panels: a joint consensus recommendation of the Association for Molecular Pathology and College of American Pathologists. J Mol Diagn. (2017) 19:341–65. doi: 10.1016/j.jmoldx.2017.01.011