wyniki i dyskusja
biblioteka cDNA Arabidopsis została przebadana przy użyciu metody przesiewowej wiązania CaM oznaczonej etykietą 35S, zgodnie z opisem (24). Jeden z dodatnich klonów wykazał identyczną sekwencję nukleotydów do AtCat3 w bazie danych (GenBank accession no. U43147). Aby udowodnić, że AtCat3 kodował białko wiążące CaM, pełny region kodujący AtCat3 został podklonowany do wektora ekspresji pET14b. Rekombinowany AtCat3 był indukowany izopropylowym β-D-tiogalaktozydem (Iptg) (rys., 1A) i został oczyszczony przez chromatografię powinowactwa CaM do niemal jednorodności. Całkowity ekstrakt bakteryjny został użyty do testu wiązania cam i wykazano, że znakowany 35s CaM wiąże się z białkiem AtCat3 w obecności Ca2+ (rys. 1a). Po dodaniu EGTA nie zaobserwowano wiązania CaM. Co więcej, znakowany 35S CaM nie wiązał się z AtCat3, gdy CaCl2 został zastąpiony przez inne kationy dwuwartościowe, takie jak MgCl2 lub MnCl2 (rys. 1A), co sugeruje, że Wiązanie CaM z AtCat3 jest zależne od Ca2+.
Cam binding to AtCat3., A) całkowite białka bakteryjne z atcat3 typu dzikiego zostały poddane barwieniu SDS/PAGE i coomassie lub przeniesione na błonę nitrocelulozową. Membrana inkubowana była z 35S-znakowaną krzywką 50 nM w buforze zawierającym 0,4 mm EGTA, 0,2 mm CaCl2, 0,2 mm MgCl2 lub 0,2 mm MnCl2. (Po lewej) żel do barwienia Coomassie pokazujący indukcję AtCat3 przez IPTG. (Po prawej) test wiązania CaM pokazujący, że CaM specyficznie wiąże się z AtCat3 w obecności wapnia. B) mapowanie regionu wiązania CaM W AtCat3., (Po lewej) żel do barwienia Coomassie pokazujący całkowite białka z mutantów typu dzikiego lub delecji AtCat3 po indukcji IPTG. (Po prawej) test wiązania CaM pokazujący, że wapń/CaM wiąże się z typem dzikim i mutantem 1-451, ale nie z mutantem 1-414. (C) Gel mobility-shift test pokazujący Wiązanie CaM z syntetycznym peptydem (aminokwasy 415-451 w atcat3) (po lewej) w obecności 0,2 mM CaCl2 i (po prawej) w obecności 0,4 mM EGTA.
aby zidentyfikować obszar wiążący CaM W atcat3, dwa mutanty delecji terminala C zostały użyte do testów wiążących CaM 35S. W obecności 0.,2 mm Ca2+, CaM wiąże się z typem dzikim i mutantem 1-451, podczas gdy CaM nie wiąże się z mutantem 1-414 (rys. 1B), co sugeruje, że region wiązania CaM dla AtCat3 jest ograniczony do aminokwasów 415-451. W celu dalszego potwierdzenia wiązania CaM z AtCat3 inkubowano syntetyczny peptyd odpowiadający aminokwasom 415-451 AtCat3. Powstanie kompleksu peptydowo-CaM zostało ocenione przez NONDENATURING PAGE ' a. Peptyd 36-mer jest zdolny do tworzenia stabilnego kompleksu z CaM w obecności Ca2+ (rys. 1C). W przypadku braku peptydu obserwowano pojedyncze pasmo krzywkowe., Wraz ze wzrostem stężenia peptydu pojawiło się kolejne pasmo o niskiej mobilności, reprezentujące kompleks peptydowo-CaM. Gdy stosunek molowy między peptydem a CaM wynosił 1: 1, wykryto tylko zespół peptydowo-CaM, co wskazuje, że w peptydzie jest tylko jedno miejsce wiążące CaM. W obecności EGTA nie powstał kompleks peptydowo-CaM (rys. 1C). Wyniki te wskazują, że CaM specyficznie wiąże się z atcat3 w sposób zależny od wapnia.
katalaza występuje w prawie wszystkich organizmach tlenowych. U zwierząt istnieje tylko jedna izoforma katalazy kodowana przez jeden gen., Natomiast katalaza u roślin występuje jako wiele izoform kodowanych przez małą rodzinę genów (6, 26). Przynajmniej dotyczy to monokotów, takich jak kukurydza i dikotów, takich jak tytoń, Arabidopsis i dynia, w których katalaza jest dobrze scharakteryzowana. Co ciekawe, każda z nich ma trzy izoformy kodowane przez trzy geny. Aby określić, czy wszystkie katalazy mają regiony wiążące CaM, sekwencje aminokwasowe 37 katalaz z bakterii, zwierząt i roślin porównano za pomocą programu pileup w pakiecie GCG10., Porównanie sekwencji aminokwasów wykazało bardzo wysoką homologię w n-terminalu 384 aa (około 60% podobieństwa i 50% tożsamości). Jednak w terminalu C-108 aa, gdzie znajduje się Region wiążący CaM, było bardzo małe podobieństwo między AtCat3 a innymi nieplantowymi katalazami (około 21% homologii i 14% tożsamości). Niemniej jednak wszystkie katalazy roślin wykazywały wysoką homologię w tej części (około 78% homologii i 70% tożsamości), szczególnie w regionie odpowiadającym obszarowi wiążącemu CaM W AtCat3. Rys. 2 pokazuje porównanie sekwencji C-terminala 108-aa 13 reprezentatywnych katalaz., Chociaż sekwencje aminokwasów w charakteryzowanych białkach wiążących CaM nie są zachowane w regionie wiążącym cam, większość z nich ma drugorzędną cechę strukturalną, podstawową amfifilową α-helisę (27), taką jak regulowane auksyną białko ZmSAUR1 (24) i roślinną chimeryczną kinazę białkową Ca2+/cam (28). Zauważ, że w regionach wiążących CaM często występują ujemnie naładowane aminokwasy, ale ładunek netto jest dodatni (16). Na podstawie projekcji koła spiralnego za pomocą programu GCG ustalono, że aminokwasy 438-451 w AtCat3 są zdolne do tworzenia podstawowej amfifilowej α-helisy., Jest oczywiste, że jedna strona koła śrubowego jest hydrofobowa, a druga strona jest hydrofilowa z dodatnimi ładunkami netto. Analiza sekwencji aminokwasów odpowiadających regionowi wiązania CaM AtCat3 przewidywała istnienie podstawowej amfifilowej α-helisy w niektórych innych katalazach roślinnych. Co ciekawe, wśród trzech izoform katalazy w kukurydzy, tytoniu, Arabidopsis i dyni, istnieje co najmniej jedna izoforma o amfifilowej strukturze α-helicznej w każdym gatunku, np.,, tobacco1( aminokwasy 431-444), maize3 (aminokwasy 442-455) i pumpkin1 (aminokwasy 438-451), a także Arabidopsis AtCat1 (aminokwasy 438-451). To, czy jest to prawda dla wszystkich gatunków roślin, nie jest jasne ze względu na ograniczone sekwencje katalazy dla innych gatunków roślin w GenBank. Na podstawie danych o strukturze krystalicznej katalaz bakteryjnych i ssaków, α-helisy są typowymi strukturami w C-końcowej części tych katalaz (29), ale nie istnieje podstawowa amfifilowa struktura α-heliczna w tej części zgodnie z projekcją koła spiralnego.,
aby sprawdzić, czy cam wiąże się z oczyszczoną katalazą z Planty, katalazę tytoniową oczyszczono z liści na podstawie Durnera i Klessiga (10). Jako ostatni etap procesu oczyszczania zastosowano kolumnę CaM-Sepharose. Podsumowanie etapów oczyszczania katalazy przy użyciu 1000 g liści tytoniu przedstawiono w tabeli 1. Katalaza tytoniowa została oczyszczona do niemal jednorodności, zgodnie z oceną SDS / PAGE i barwienia srebrem (rys. 3, Pas 1). Tożsamość katalazy została potwierdzona przez Western blotting z mAb przeciwko katalazy tytoniu (rys. 3, Pas 3)., Wiązanie CaM z oczyszczoną katalazą tytoniową wykazano za pomocą następujących metod. i) do oczyszczania katalazy tytoniowej użyto kolumny CaM-sefarozy. Współczynnik odzysku dla tego etapu wynosił 81% (Tabela 1), co sugeruje, że większość katalazy z liści tytoniu jest białkiem wiążącym CaM. (ii) do badania wiązania z oczyszczoną katalazą w obecności 0,2 mM CaCl2 (rys. 3, pas 5). Rekombinowany AtCat3 został użyty jako kontrolny (rys. 3, pasy 2, 4 i 6). Dodanie 0.,4 mM EGTA zniosła Wiązanie CaM, co sugeruje, że CaM wiąże się z katalazą roślinną w sposób zależny od Ca2+. Testy wiązania CaM przeprowadzono również w celu określenia, czy wiąże się z grzybiczą, bydlęcą lub ludzką katalazą. Wyniki wykazały, że żadna z tych nieplanowanych katalaz nie wykazała żadnego wiązania CaM( dane nie pokazano), co jest zgodne z porównaniami sekwencji aminokwasów (rys. 2).,
- wyświetl inline
- wyświetl popup
Oczyszczanie katalazy z liści tytoniu
CaM wiąże się z katalazą roślinną. Pas 1, srebrne zabarwienie pokazujące czystość katalazy z liści tytoniu. Lane 3, Western blot pokazuje, że monoklonalne przeciwciało katalazy tytoniowej może wykryć oczyszczoną katalazę. Lane 5, Test wiązania CaM pokazujący, że 35S-CaM wiąże się z oczyszczoną katalazą. Dwa mikrogramy rekombinowanego AtCat3 były ładowane jako kontrola w każdym eksperymencie(Pasy 2, 4 i 6).,
miejsce wiązania CaM lub ściśle zestawione regiony w innych charakteryzujących się białkach wiążących cam często funkcjonują jako domeny autoinhibicyjne lub pseudosubstratowe. Region ten utrzymuje białka docelowe w stanie nieaktywnym przy braku sygnału Ca2+, jak w chimerycznej kinazie białkowej Ca2+/Cam (30) i dekarboksylazie glutaminianowej (31). W celu zbadania znaczenia wiązania CaM z katalazami roślinnymi, mierzono aktywność katalityczną rekombinowanej AtCat3 i oczyszczonej katalazy tytoniowej w obecności i braku CaCl2 i cam., Podobne eksperymenty przeprowadzono również przy użyciu innych nieplantowych katalizatorów. Rekombinowany atcat3, wyrażony przez E. coli, nie wykazywał aktywności. Podobne wyniki uzyskano w innym laboratorium (Zhixiang Chen, komunikacja osobista). Może to wynikać z braku utworzenia właściwej struktury dla rekombinowanej katalazy, ponieważ aktywna katalaza jest tetramerem składającym się z czterech identycznych lub podobnych podjednostek (6, 10, 26). Natomiast oczyszczona katalaza tytoniowa wykazywała znaczącą zależną od Ca2+/CaM zmianę aktywności podczas etapów oczyszczania (Tabela 1)., Efekty stymulujące Ca2+ / CaM są około 2,2-krotnie w każdym etapie, z wyjątkiem próbki, która została uzyskana po chromatografii Cam-Sepharose. Wykazano większą stymulację aktywności katalazy (2,5-krotnie), prawdopodobnie z powodu usunięcia frakcji katalazy nie wiążącej Ca2+ / CaM (Tabela 1). Frakcja katalazy nie wiążącej Ca2+/CaM wykazywała specyficzną aktywność 59,6 jednostki (aktywność podstawowa). Jednak Ca2+ / CaM nie stymulował aktywności tej frakcji katalazy (dane nie pokazano)., Wyniki te wskazują, że Ca2+/Cam jest w stanie aktywować katalazę tytoniową we frakcji otrzymanej po chromatografii Cam-Sefarozowej, co odpowiada wynikom wiązania CaM. Aby porównać wpływ Ca2+ / CaM na aktywność katalaz z różnych źródeł, wykorzystano relatywną aktywność, ponieważ istnieje znaczna różnica w specyficznej aktywności katalaz z różnych gatunków. Na przykład katalaza A. niger ma specyficzną aktywność 5,7 jednostek; katalaza wątroby bydlęcej, 51,9 jednostek; erytrocyty ludzkie, 39,5 jednostek; katalaza tytoniowa, 63.,1 jednostki (w przypadku braku Ca2+/CaM). Rys. 4A pokazuje, że sam CaCl2 lub sam CaM nie miały stymulującego wpływu na aktywność katalazy tytoniowej(około 40% maksymalnej aktywności). Nie zaobserwowano różnic w aktywności katalitycznej w grzybiczych, bydlęcych lub ludzkich katalazach w obecności lub braku Ca2+, CaM i Ca2+ / Cam (ryc. 4A). Zastąpienie CaCl2 MgCl2 nie spowodowało istotnej zmiany aktywności katalazy tytoniowej w obecności lub braku CaM (dane nie pokazano)., W celu dalszego udokumentowania wpływu Ca2+ / Cam na aktywność katalazy roślin, do każdej mieszaniny reakcyjnej Dodano 10 µM peptydu odpowiadającego regionowi wiążącemu AtCat3 CaM (415-451). Nonplant katalazy nie zostały naruszone przez dodanie peptydu. Jednak stymulujący wpływ Ca2+ / CaM na aktywność katalazy tytoniowej został zniesiony przez dodanie peptydu (rys. 4A). Ponadto hamujący wpływ peptydu na aktywność katalazy tytoniowej zależał od stężenia peptydu (rys. 4B)., Aktywność katalazy została zahamowana o około 58%, co jest zbliżone do podstawowej aktywności katalazy. Jednak peptyd nie miał wpływu na aktywność katalazy bydlęcej we wszystkich badanych stężeniach(ryc. 4A). Wyniki te sugerują, że Ca2+/CaM ma stymulujący wpływ na oczyszczoną katalazę roślinną, ale nie ma wpływu na katalazy nieplant.
wapń/CaM reguluje aktywność katalityczną katalazy roślinnej. Aktywność katalazy mierzono poprzez monitorowanie rozpadu H2O2 w 240 nm przed i po dodaniu katalazy w obecności i braku Ca2+ i (lub) CaM., Aktywność została wyrażona jako procent maksymalnej aktywności dla każdej katalazy. Dane są średnią ± SE z czterech oddzielnych eksperymentów. A) CaM aktywuje katalazę tytoniową w obecności wapnia. Peptyd odpowiadający regionowi wiązania CaM W AtCat3 (aminokwasy 415-451) hamuje aktywność katalazy tytoniowej. B) Kinetyka hamowania aktywności katalazy tytoniowej przez peptyd (aminokwasy 415-451). ● , katalaza wątroby bydlęcej;○, katalaza tytoniowa.,
wiadomo, że katalaza jest dominującym enzymem peroksysomalnym, ale występuje również w mitochondriach i cytoplazmie (32). Na przykład kukurydza Cat3, która może być katalazą wiążącą CaM na podstawie porównania sekwencji aminokwasów, jest białkiem mitochondrialnym (33). Nasze wyniki (rys. 1-4) wykazują, że CaM wiąże się z katalazą roślinną i reguluje jej aktywność. Aby wykazać obecność tej aktywności regulacyjnej in vivo, badaliśmy, czy CaM współistnieje z katalazą w peroksysomach roślin., Organelle z etiolowanych ekstraktów liścienia dyniowego oddzielono przez odwirowanie gęstości sacharozy. Aby usunąć zanieczyszczenia białek cytozolowych, które mogą być obecne w roztworze lub tylko związane z błoną peroksysomalną, izolowane peroksysomy były leczone proteinazą K. w ten sposób białka peroksysomalne chronione przed proteazą przez błonę peroksysomalną nie były trawione (34, 35). Tożsamość frakcji peroksysomalnych udowodniono mierząc aktywność katalazy (35)., CaM jest bardzo zachowany w królestwach (13-16), stąd zrobiliśmy analizę zachodnią z przeciwciałem anty-ludzkim CaM. Jako kontrolę zastosowano rekombinowany ziemniak cam PCM6 (rys. 5, pas 3). Co ciekawe, pasmo o wielkości zbliżonej do PCM6 było obecne we frakcjach peroksysomalnych, ale intensywność była znacznie niższa w porównaniu do CaM cytozolowego (rys. 5). Wyniki te wskazują, że cam i katalaza są kolokalizowane w peroksysomach. CaM jest małym kwaśnym białkiem, który jest wyrażany głównie w cytoplazmie., Jednak u roślin wykazano, że CaM jest obecny w kilku organelach, takich jak jądro i chloroplasty (36, 37) i macierz pozakomórkowa (38). Ponadto białka regulowane przez CaM występują w macierzy pozakomórkowej, jądrze i chloroplastach (38-40). Jak CaM przecina membranę nie jest jasne. Ostatnie badania wskazują, że modyfikacje posttranslacyjne odgrywają rolę w translokacji niektórych izoform CaM. Na przykład białko petunia cam-like, CaM53, jest związane z błoną osocza, gdy białko jest prenylowane. Jeśli prenylacja jest hamowana, CaM53 znajduje się głównie w jądrze (41).,
istnienie CaM w peroksysomach. Dwadzieścia mikrogramów wszystkich białek z peroksysomu i cytozolu zostało oddzielonych w 15% SDS / strona i poddanych analizie Zachodniej. CaM został wykryty przez przeciwciało przeciw bydlęce CaM. Jako środek kontrolny zastosowano dwa mikrogramy rekombinowanego CaM pcm6 ziemniaka. Pas 1, frakcja peroksysomów; pas 2, frakcja cytozolu; pas 3, PCM6.
według naszej wiedzy, nie ma raportu, który omawia stężenie wapnia w peroksysomach., W oparciu o niedawno zmodyfikowany model biogenezy peroksysomu, peroksysom pochodzi z retikulum endoplazmatycznego (ER) za pomocą pęcherzyków przedperoksysomalnych (42). Wiadomo, że ER jest jednym z wewnątrzkomórkowych basenów wapnia. Tak więc stężenie wapnia w peroksysomach może być tak wysokie, jak w ER. Pomiar peroksysomalnego stężenia wapnia i monitorowanie jakiegokolwiek związku między zmianą stężenia wapnia w cytoplazmie a peroksysomem powinno pomóc w naszym zrozumieniu, w jaki sposób peroksysomalna katalaza jest regulowana przez Ca2+/Cam., Na przykład stężenie wolnego wapnia można zmierzyć w roślinach transgenicznych za pomocą odtworzonej aequoriny z sygnałem ukierunkowanym na peroksysom. Aequorin jest białkiem luminescencyjnym wrażliwym na wapń, którego luminescencja bezpośrednio informuje o zmianie wapnia (43). Ponieważ peroksysom jest głównym organelle, która usuwa toksyczne ROS, głównie H2O2, uzasadnione jest spekulowanie, że aktywność katalizy peroksysomalnej pozostaje wysoka przez cały czas, aby degradować H2O2 in situ w szybkim tempie. Jednak fluktuacje wapnia cytozolowego mogą mieć istotny wpływ na aktywność katalazy cytozolowej., Należy podkreślić, że nie wszystkie katalazy są białkami wiążącymi CaM. W związku z tym potrzebne są dalsze badania, aby zająć się znaczeniem Ca2+ / Cam w kontrolowaniu aktywności katalazy w różnych organelles.
naprężenia biotyczne i abiotyczne wywołują napływ Ca2+, a zwiększony Cytozolowy Ca2 + stymuluje produkcję H2O2, która dyfunduje do otaczających komórek jako przekaźnik i indukuje odpowiedź fizjologiczną (19, 20). Nasze wyniki sugerują, że zwiększony cytozolowy Ca2+ może obniżyć poziom H2O2 poprzez stymulację aktywności katalazy za pośrednictwem Ca2+ / Cam (rys. 4)., Proponujemy, aby zwiększony Cytozolowy Ca2+ odgrywał podwójną rolę w regulacji homeostazy H2O2 (rys. 6): (i) regulacja dodatnia generuje H2O2 poprzez bezpośrednie aktywowanie oksydazy NADPH, która ma powinowactwo do Ca2+ (22) i pośrednio wytwarza więcej NADPH za pomocą regulowanej przez Ca2+/cam kinazy NAD (23); oraz (ii) Regulacja ujemna redukuje H2O2 poprzez stymulowanie aktywności katalazy poprzez modulację Ca2+/Cam (rys. 4)., Zmiany wywołane sygnałem w Ca2 + transients mogą różnić się częstotliwością, czasem trwania, amplitudą i przestrzenną lokalizacją oscylacji oraz sposobem propagacji przestrzennej, co prowadzi do różnicowania wpływu na białka docelowe wapnia (12, 44).
Model pokazujący zmiany wywołane przez Ca2+prowadzące do pozytywnej i negatywnej regulacji poziomu H2O2 w roślinach. W celu regulacji dodatniej sygnały zewnątrzkomórkowe wywołują napływ Ca2+, co zwiększa wytwarzanie H2O2., Może to nastąpić poprzez aktywację oksydazy NADPH, która ma powinowactwo do Ca2+ i zwiększenie produkcji NADPH za pomocą regulowanej przez CaM kinazy NAD. W przypadku regulacji ujemnej Ca2 + wiąże się z CaM, a kompleks Ca2+/cam stymuluje aktywność katalityczną katalazy, prowadząc do szybkiej degradacji H2O2. Wzrost H2O2 może zwiększyć napływ Ca2+ poprzez aktywację kanału wapniowego.
