diagnóstico laboratorial de hemoglobinopatias
a investigação primária de uma hemoglobinopatia deve incluir uma contagem completa do sangue, película de sangue periférico e electroforese da hemoglobina (ver Fig. 29.4). A contagem completa de células sanguíneas permite a avaliação da formação de hemoglobina, de acordo com os índices de glóbulos vermelhos, o volume médio das células (MCV) e a hemoglobina média das células (MCH)., Microcytosis (VCM < 76 fL) e hipocromia (MCH < 27 pg), em face de uma normal ou aumentada contagem de glóbulos vermelhos (> 5.5 × 1012/L) em um ferro-repleto paciente, sugerir o diagnóstico de talassemia. No caso de β talassemia major ou intermedia, esta está associada a um grau significativo de anemia, enquanto que no traço de talassemia a hemoglobina é normalmente normal ou apenas marginalmente reduzida. O exame de uma película de sangue manchada por um método de Giemsa pode ser útil para confirmar o diagnóstico., No entanto, o diagnóstico definitivo baseia-se frequentemente na análise electroforética ou cromatográfica da hemoglobina em hemolisatos de glóbulos vermelhos. A eletroforese do acetato de celulose a pH alcalino (8.9–9.1) é o método mais amplamente utilizado, sendo simples, rápido, barato e eficaz na separação das variantes de hemoglobina comuns. Na anemia falciforme homozigótica, predomina a HbS. Está presente uma quantidade variável de HbF, sendo as proporções mais elevadas (> 10%) geralmente associadas a um curso clínico mais suave. A concentração de hemoglobina A2 é normalmente normal.,
testes de Solubilidade com base no menor solubilidade de desoxi-HbS na presença de agentes redutores, por exemplo ditionito de sódio, tem um papel limitado no diagnóstico de doença falciforme, pois não diferencia os homozigotos doença e estado de portador. Numa situação de emergência, um teste de solubilidade positivo realizado em conjunto com uma hemoglobina significativamente reduzida e morfologia típica dos glóbulos vermelhos aponta fortemente para um diagnóstico de anemia falciforme. Este facto deve ser confirmado pela análise da hemoglobina o mais rapidamente possível., Várias outras variantes, incluindo o HbD, o HbG e o HB Lepore, têm uma mobilidade electroforética idêntica à do HBS no acetato de celulose, mas podem ser distinguidas pelo teste de solubilidade falciforme negativo e pela electroforese em gel de citrato a pH ácido (6.0). Do mesmo modo, as hemoglobinas C, E e O, que co-migram em acetato de celulose a pH alcalino, podem ser diferenciadas por eletroforese de agar citrato. Tanto o HBE como o HB Lepore estão associados a índices de glóbulos vermelhos talassémicos, o que ajuda ainda mais a sua distinção de variantes electroforeticamente semelhantes., Focagem isoelétrica melhora a resolução de algumas variantes estruturais e também pode ser usado para triagem neonatal de eluatos de placas Guthrie (mancha de sangue seca), uma vez que reduz a interferência da meta-hemoglobina presente em tais amostras.
cromatografia líquida de alta resolução (HPLC) é um método rápido e sensível para a separação e quantificação de hemoglobinas que, em alguns casos, permite a identificação de variantes Não possíveis por outras técnicas., Uma vez que é largamente automatizada e requer quantidades mínimas de amostra, a HPLC tornou-se o método de escolha para testes em grande escala da população, tais como programas de rastreio neonatal. O rastreio neonatal Universal da doença das células falciformes tem sido utilizado nos EUA e na Inglaterra há algum tempo, e programas semelhantes estão a ser introduzidos noutros países europeus, do Médio Oriente e africanos, dependendo da prevalência das condições e dos recursos disponíveis., Tais programas resultaram em benefícios significativos em termos de redução da mortalidade e morbilidade devido à melhoria dos cuidados, implementação precoce da profilaxia contra a infecção pneumocócica e educação parental. Em β talassemia, a proporção de hemoglobinas individuais varia com o genótipo subjacente. Homozigotos talassemia β0 é associado com uma predominância de HbF, ausência de HbA e quantidades variáveis de HbA2 (intervalo de 1.0–6.0%, com média de 1.7%). Em indivíduos com β+ talassemia homozigótica ou heterozigótica β0 / β+ talassemia composta, está presente uma quantidade variável de HbA., A hemoglobina F é aumentada e distribuída de forma heterogénea entre os glóbulos vermelhos.a quantificação precisa do HbA2 por cromatografia HPLC ou microcoluna é essencial para o diagnóstico da característica β talassemia, na qual o HbA2 é elevado, tipicamente
3,5%., Os portadores de talassemia “normal A2” ou “silenciosa” β devido a defeitos ligeiros do gene β ou à co-herança de uma mutação do gene δ em cis ou trans não podem ser facilmente distinguidos da Talassemia por métodos convencionais de rastreio e necessitam de investigação através de técnicas especializadas, incluindo a síntese in vitro da cadeia globina e a análise do ADN. A análise das razões sintéticas da cadeia globina por incorporação de leucina tritiada e cromatografia carboximetilcelulose é a forma definitiva de identificar indivíduos com talassemia, embora raramente seja utilizada devido à sua natureza laboriosa.,as talassemias α são caracterizadas eletroforeticamente pela presença das variantes em movimento rápido, HB Bart’s (γ4) e HbH (β4), que são mais óbvias em amostras neonatais. No hidrops fetalis devido à talassemia α0 homozigótica, o HB Bart predomina e é encontrado em quantidades menores em outras síndromes de talassemia α no período neonatal. A hemoglobina H pode também ser detectada através da coloração dos corpos de inclusão da HbH., O diagnóstico de formas clinicamente silenciosas de α talassemia é frequentemente de exclusão, sendo feito com base na origem étnica do indivíduo, índices hipocrómicos hipocrómicos hipocrómicos microcíticos e uma concentração normal ou baixa de HbA2 na presença de estado normal de ferro. O diagnóstico definitivo pode ser feito por análise de DNA, que também pode distinguir frequentemente α0 e α+ talassemia.,embora a maioria das hemoglobinopatias possa ser diagnosticada por electroforese de hemoglobina, variantes causadas por substituições de aminoácidos que não alteram a carga, tais como as encontradas em algumas hemoglobinas instáveis ou hemoglobinas com afinidade alterada de oxigénio, podem escapar à detecção. Outras investigações que podem ser úteis neste contexto incluem a avaliação da instabilidade da hemoglobina e afinidade com o oxigénio., A análise de DNA de alto rendimento tornou esta uma forma viável de rastreamento de mutações globinas em países ricos, com técnicas como a amplificação de sonda dependente da ligação multiplex permitindo a identificação de grandes mutações genéticas que anteriormente só eram detectáveis usando blotting do Sul. A espectrometria de massa de hemoglobina também pode ser usada para identificar globinas anormais medindo sua massa com precisão, com particular potencial uso em programas de triagem que já usam espectrometria de massa.,a identificação de casais em risco de hemoglobinopatias importantes por rastreio pré-natal ou pré-conceitual permite a escolha reprodutiva informada com a opção de diagnóstico pré-natal. Na maioria dos casos, isso pode agora ser realizado no primeiro trimestre pela detecção de genes globinos mutantes em DNA coriônico villous. Em vários países, nomeadamente em Chipre, onde a taxa portadora da Talassemia β atinge os 12%, esta situação conduziu a uma diminuição acentuada da incidência de perturbações da hemoglobina no nascimento., O diagnóstico genético pré-implantação é cada vez mais utilizado para permitir a seleção de embriões não afetados, embora continue a ser um processo exigente e caro que não é aplicável à maioria dos casais. As tentativas continuam a desenvolver um diagnóstico pré-natal não invasivo utilizando células fetais e ADN no sangue materno, embora tal não seja tecnicamente viável como procedimento de rotina para as hemoglobinopatias.
