Results and Discussion
The Arabidopsis cDNA library was screened by using the 35S-labeled CaM-binding screening approach as described (24). Um dos clones positivos mostrou uma sequência nucleotídica idêntica ao AtCat3 na base de dados (GenBank accession no. U43147). Para provar que o AtCat3 codificou uma proteína de ligação CaM, a região de codificação completa do AtCat3 foi subclonada para o vetor de expressão pET14b. O AtCat3 recombinante foi induzido pelo β-d-tiogalactosido isopropilo (IPTG) (Fig., 1-A) e foi purificada por cromatografia de afinidade da câmara até quase homogeneidade. O extracto bacteriano Total foi utilizado para o ensaio de ligação à CaM, e foi demonstrado que a CaM marcada com 35S se liga à proteína AtCat3 na presença de Ca2+ (Fig. 1A). Após a adição de EGTA, não foi observada qualquer ligação à Câmara. Além disso, o 35S-rotulado CaM não se ligou ao AtCat3 quando CaCl2 foi substituído por outros cátions divalentes como MgCl2 ou MnCl2 (Fig. 1A), sugerindo que a ligação CaM Ao AtCat3 é Ca2+-dependente.
CaM binding to AtCat3., A) as proteínas bacterianas totais provenientes de AtCat3 de tipo selvagem foram submetidas a SDS/PAGE e a coloração de Coomassie ou transferidas para uma membrana nitrocelulose. A membrana foi incubada com uma came de 50 nM marcada com 35S num tampão contendo 0,4 mm EGTA, 0,2 mM CaCl2, 0,2 mM MgCl2, ou 0,2 mM MnCl2. Gel de coloração de Coomassie que mostra a indução do AtCat3 pela IPTG. (Direito) ensaio de ligação CaM que demonstra que a CaM se liga especificamente ao AtCat3 na presença de cálcio. B) mapeamento da região de ligação da CaM em AtCat3., (À esquerda) gel de coloração de Coomassie que mostra o total de proteínas de tipos selvagens ou mutantes de deleção de AtCat3 após indução da IPTG. (Direito) Ensaio De Ligação Da CaM mostrando que o cálcio/CaM se liga ao tipo selvagem e ao mutante 1-451, mas não ao mutante 1-414. C) Ensaio de mobilidade em Gel-shift que mostra a ligação da CaM ao péptido sintético (aminoácidos 415-451 no AtCat3) (à esquerda) na presença de CaCl2 de 0,2 mM e (à direita) na presença de EGTA de 0,4 mM.
para identificar a área de ligação à câmara no AtCat3, foram utilizados dois mutantes de supressão C-terminal para ensaios de ligação à Câmara 35S. Na presença de 0.,Ca2+ de 2 mM, a CaM liga-se ao tipo selvagem e mutante 1-451, enquanto que a CaM não se liga ao mutante 1-414 (Fig. 1B), sugerindo que a região de ligação da CaM para o AtCat3 está restrita a aminoácidos 415-451. Para confirmar a ligação da CaM ao AtCat3, um peptídeo sintético correspondente a aminoácidos 415-451 do AtCat3 foi incubado com CaM. A formação do complexo peptídeo-CaM foi avaliada pela página de não cura. O peptídeo de 36-mer é capaz de formar um complexo estável com CaM na presença de Ca2+ (Fig. 1C). Na ausência de peptídeo, foi observada uma única banda CaM., À medida que a concentração do peptídeo aumentava, outra banda com baixa mobilidade apareceu, representando o complexo peptídico-CaM. Quando a razão molar entre o peptídeo e a CaM era de 1:1, apenas a banda complexa peptídica-CaM foi detectada, indicando que existe apenas um local de ligação à CaM no peptídeo. Nenhum complexo peptídico-CaM foi formado na presença de EGTA (Fig. 1C). Estes resultados indicam que CaM se liga especificamente ao AtCat3 de forma dependente do cálcio.a Catalase existe em quase todos os organismos aeróbicos. Em animais, há apenas uma catalase isoforma codificada por um único gene., Em contraste, a catalase nas plantas está presente como várias isoformas codificadas por uma pequena família de genes (6, 26). Pelo menos isso é verdade em monocotiledóneas, como o milho e dicotiledóneas, como o tabaco, Arabidopsis e abóbora, em que catalase é bem caracterizada. Curiosamente, cada um deles tem três isoformas codificadas por três genes. Para determinar se todas as catalases têm as regiões de ligação CaM, as sequências de aminoácidos de 37 catalases de bactérias, animais e plantas foram comparadas usando o programa pileup no Pacote GCG10., A comparação da sequência de aminoácidos revelou uma homologia muito elevada no n-terminal 384 aa (cerca de 60% de semelhança e 50% de identidade). No entanto, no C-terminal 108 aa, onde a região de ligação CaM está localizada, houve muito pouca semelhança entre AtCat3 e outros catalases não-plantes (cerca de 21% homologia e 14% identidade). No entanto, todos os catalases das plantas apresentaram alta homologia nesta porção (cerca de 78% homologia e 70% identidade), particularmente na região correspondente à área de ligação CaM na AtCat3. Figo. 2 mostra a comparação da sequência C-terminal 108-aa de 13 catalases representativas., Embora as sequências de aminoácidos nas proteínas de ligação à CaM caracterizadas não sejam conservadas na região de ligação à CaM, a maioria delas tem uma característica estrutural secundária, a α-helix anfifílica básica (27), Como a proteína zmsaur1 regulada pelo auxin (24) e a proteína quimérica Ca2+/cam cinase proteica (28). Note que existem muitas vezes aminoácidos negativamente carregados em regiões de ligação CaM, mas a carga líquida é positiva (16). Baseado na projeção helicoidal usando o programa GCG, foi determinado que os aminoácidos 438-451 em AtCat3 são capazes de formar uma α-helix anfifílica básica., É claro que um lado da roda helicoidal é hidrofóbico e o outro lado é hidrofílico com cargas líquidas positivas. A análise das sequências de aminoácidos correspondentes à região de ligação da CaM de AtCat3 previu a existência de uma α-hélice anfifílica básica em algumas outras plantas catalases. Curiosamente, entre três isoformas catalásicas em milho, tabaco, Arabidopsis e abóbora, há pelo menos uma isoforma com a estrutura anfifílica α-helicoidal em cada espécie, e.g.,, tobacco1 (aminoácidos 431-444), maize3 (aminoácidos 442-455), e pumpkin1 (aminoácidos 438-451), bem como a Arabidopsis AtCat1 (aminoácidos 438-451). Se é verdade para todas as espécies de plantas não é claro devido às limitadas sequências de catalase para outras espécies de plantas em GenBank. Com base nos dados da estrutura cristalina das catalases bacterianas e mamíferas, α-hélices são as estruturas típicas na porção C-terminal destas catalases (29), mas nenhuma estrutura básica de α-hélice anfifílica existe nesta porção de acordo com a projeção da roda helicoidal.,
para testar se CaM se liga à catalase purificada da planta, a catalase do tabaco foi purificada a partir das folhas com base em Durner e Klessig (10). Uma coluna CaM-Sefarose foi usada como o último passo no processo de purificação. O resumo das etapas de purificação da catalase usando 1.000 g de folhas de tabaco é apresentado na Tabela 1. A catalase do tabaco foi purificada até à quase homogeneidade avaliada pela SDS / PAGE e pela coloração de prata (Fig. 3, lane 1). A identidade da Catalase foi confirmada por Western blotting com um mAb contra a catalase do tabaco(Fig. 3, lane 3)., A ligação CaM à catalase do tabaco purificado foi demonstrada pelas seguintes abordagens. – foi utilizada uma coluna CaM-Sefarose para a purificação da catalase do tabaco. A taxa de recuperação para esta etapa foi de 81% (Tabela 1), sugerindo que a maior parte da catalase das folhas de tabaco é uma proteína de ligação à CaM. (ii) foi utilizada uma CaM marcada com 35S para testar a ligação à catalase purificada na presença de CaCl2 de 0,2 mM (Fig. 3, lane 5). O AtCat3 recombinante foi utilizado como controlo(Fig. 3, faixas 2, 4 e 6). Adição de 0.,4 mM EGTA aboliu a ligação CaM, sugerindo que CaM se liga à catalase da planta de uma maneira Ca2+-dependente. Também foram realizados ensaios de ligação à CaM para determinar se esta se liga à catalase fúngica, bovina ou humana. Os resultados revelaram que nenhuma destas catalases não-plantantes mostrou qualquer ligação CaM (dados não mostrados), o que está de acordo com as comparações de sequência de aminoácidos (Fig. 2).,
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a Purificação da catalase de folhas de tabaco
CaM liga a planta de catalase. Lane 1, manchas de prata mostrando a pureza da catalase das folhas de tabaco. Lane 3, Western blot mostrando que o anticorpo monoclonal da catalase do tabaco pode detectar catalase purificada. Pista 5, Ensaio De Ligação à câmara que mostra que a câmara 35S se liga à catalase purificada. O AtCat3 recombinante de dois microgramas foi carregado como um controlo em cada experiência (faixas 2, 4 e 6).,
o local de ligação à CaM ou regiões estreitamente justapostas noutras proteínas de ligação à CaM caracterizadas muitas vezes funcionam como domínios autoinibitórios ou pseudosubstratos. Esta região mantém as proteínas-alvo num estado inactivo na ausência de sinal Ca2+, tal como na proteína quimérica Ca2+/CaM-dependente cinase proteica (30) e na descarboxilase do glutamato (31). Para estudar o significado da ligação da CaM às catalases vegetais, as actividades catalíticas do AtCat3 recombinante e da catalase do tabaco purificado foram medidas na presença e ausência de CaCl2 e CaM., Experiências semelhantes também foram realizadas utilizando outros catalisadores não-activos. O AtCat3 recombinante, expresso em E. coli, não mostrou actividade. Resultados semelhantes foram obtidos em outro laboratório (Zhixiang Chen, comunicação pessoal). Isto pode ter resultado da falha em formar a estrutura correta para a catalase recombinante, porque a catalase ativa é um tetrâmero composto de quatro subunidades idênticas ou similares (6, 10, 26). Em contrapartida, a catalase do tabaco purificado apresentou uma alteração significativa da actividade, dependente da Ca2+/CaM, durante as fases de purificação (Quadro 1)., Os efeitos estimuladores de Ca2+ / CaM são cerca de 2,2 vezes em cada etapa, exceto a amostra obtida após a cromatografia de CaM-Sefarose. Demonstrou uma estimulação mais elevada da actividade da catalase (2, 5 vezes), possivelmente devido à remoção da fracção catalase não-Ca2+/CaM (Tabela 1). A fracção catalase não-Ca2+ / CaM tinha uma actividade específica de 59,6 unidades (actividade basal). No entanto, Ca2+ / CaM não estimulou a actividade desta fracção da catalase (dados não apresentados)., Estes resultados indicam que Ca2+/CaM é capaz de ativar a catalase do tabaco na fração que foi obtida após cromatografia de CaM-Sefarose, o que corresponde aos resultados de ligação à CaM. Para comparar os efeitos de Ca2+ / CaM sobre a actividade dos catalases de diferentes fontes, utilizou-se a actividade relativa, porque existe uma diferença significativa na actividade específica dos catalases de diferentes espécies. Por exemplo, A. niger catalase tem a atividade específica de 5,7 unidades; catalase do fígado bovino, 51,9 unidades; eritrócitos humanos, 39,5 unidades; catalase do tabaco, 63.,1 unidades (na ausência de Ca2+/CaM). Figo. 4A mostra que CaCl2 sozinho ou CaM sozinho não teve nenhum efeito estimulante na atividade da catalase do tabaco (cerca de 40% da atividade máxima). Não foi observada diferença na actividade catalítica em catalases fúngicas, bovinas ou humanas na presença ou ausência de Ca2+, CaM e Ca2+/CaM (Fig. 4A). Ao substituir CaCl2 por MgCl2, não houve alteração significativa na atividade da catalase do tabaco na presença ou ausência de CaM (dados não apresentados)., Para documentar o efeito de Ca2+ / CaM na actividade da catalase vegetal, adicionou-se a cada mistura de reacção 10 µM do péptido correspondente à região de ligação da CaM AtCat3 (415-451). A adição do peptídeo não afetou as catalases não-plantantes. No entanto, o efeito estimulante da Ca2+/CaM sobre a actividade da catalase do tabaco foi abolido pela adição do peptídeo (Fig. 4A). Além disso, o efeito inibitório do peptídeo na actividade da catalase do tabaco dependia da concentração do peptídeo (Fig. 4B)., A actividade da catalase foi inibida em cerca de 58%, o que está próximo da actividade basal da catalase. Contudo, o peptídeo não teve qualquer efeito na actividade da catalase bovina em todas as concentrações testadas (Fig. 4A). Estes resultados sugerem que Ca2+ / CaM tem um efeito estimulante sobre a catalase purificada da planta, mas não tem efeito sobre as catalases não-plantantes.
cálcio / CaM regula a actividade catalítica da catalase vegetal. A actividade da catalase foi medida pela monitorização do decaimento H2O2 a 240 nm antes e depois da adição da catalase na presença e ausência de Ca2+ e/ou CaM., A actividade foi expressa em percentagem da actividade máxima para cada catalase. Os dados são a média ± SE de quatro experiências separadas. A) A CaM activa a catalase do tabaco na presença de cálcio. O peptídeo correspondente à região de ligação à CaM no AtCat3 (aminoácidos 415-451) inibe a actividade da catalase do tabaco. B) cinética da inibição da actividade da catalase do tabaco por peptídeo (aminoácidos 415-451). ● , catalase do fígado bovino;○, catalase do tabaco.,
sabe-se que a catalase é uma enzima peroxisómica predominante, mas também existe na mitocôndria e no citoplasma (32). Por exemplo, o milho Cat3, que pode ser uma catalase de ligação CaM com base na comparação da sequência de aminoácidos, é uma proteína mitocondrial (33). Os nossos resultados (figos. 1-4) demonstrar que a CaM se liga à catalase vegetal e regula a sua actividade. Para demonstrar a presença desta atividade regulatória in vivo, estudamos se CaM coexiste com catalase nos peroxissomas das plantas., As organelas dos extratos etiolados de algodão foram separadas por centrifugação de densidade de sacarose. Para remover a contaminação de cytosolic proteínas que podem estar presentes em solução ou meramente associados com o peroxisomal membrana, o isolado peroxisomes foram tratados com proteinase K. desta forma, o peroxisomal proteínas blindado de protease pelo peroxisomal membrana não foram digeridos (34, 35). A identidade das frações peroxisômicas foi provada pela medição da atividade da catalase (35)., A CaM é muito conservada entre os reinos (13-16), por isso fizemos uma análise ocidental com um anticorpo anti-humano. Como controlo, foi utilizada a cam de batata recombinante PCM6 (Fig. 5, lane 3). Curiosamente, uma banda em um tamanho semelhante ao PCM6 estava presente nas frações peroxisômicas, mas a intensidade foi consideravelmente menor em comparação com a CaM citosólica (Fig. 5). Estes resultados indicam que CaM e catalase são focalizados nos peroxissomas. CaM é uma pequena proteína ácida que é principalmente expressa no citoplasma., No entanto, em plantas, CaM tem sido mostrado estar presente em várias organelas, como o núcleo e cloroplastos (36, 37) e matriz extracelular (38). Além disso, proteínas cam-regulamentadas existem na matriz extracelular, núcleo, e cloroplastos (38-40). Como CaM atravessa a membrana não é claro. Estudos recentes indicam que as modificações pós-translacionais desempenham um papel na translocação de algumas isoformas da CaM. Por exemplo, uma proteína do tipo cam petunia, CaM53, está associada com a membrana plasmática quando a proteína é prenilada. Se a prenilação é inibida, o CaM53 é encontrado predominantemente no núcleo (41).,
a existência de CaM em peroxissomas. Vinte microgramas de proteínas totais do peroxisoma e do citosol foram separados em 15% SDS/PAGE e submetidos a análise Ocidental. A CaM foi detectada por um anticorpo anti-bovino. Foi utilizado como controlo dois microgramas de pcm6 recombinante da câmara de batata. Faixa 1, fracção de peroxissomas; faixa 2, fracção de citosol; faixa 3, PCM6.
tanto quanto sabemos, não há nenhum relatório que discute a concentração de cálcio nos peroxissomas., Com base num modelo modificado recente da biogénese peroxissómica, o peroxisoma é originário do retículo endoplasmático (ER) por meio de vesículas pré-peroxisómicas (42). Sabe-se que o ER é uma das piscinas intracelulares de cálcio. Assim, a concentração de cálcio nos peroxissomas pode ser tão elevada como nas urgências. A medição da concentração de cálcio peroxisómico e a monitorização de qualquer ligação entre a alteração da concentração de cálcio no citoplasma e no peroxissoma devem ajudar a compreender como a catalase peroxissómica é regulada pela Ca2+/CaM., Por exemplo, a concentração livre de cálcio pode ser medida nas plantas transgénicas com a aequorina reconstituída com um sinal direccionado para o peroxisoma. Aequorina é uma proteína luminescente sensível ao cálcio, cuja luminescência relata directamente a alteração do cálcio (43). Como o peroxisoma é uma organela importante que remove a ROS tóxica, principalmente H2O2, é razoável especular que a atividade da catalase peroxisómica permanece alta o tempo todo para degradar H2O2 in situ a uma taxa rápida. No entanto, as flutuações no cálcio citosólico podem ter um efeito importante na actividade da catalase citosólica., É importante salientar que nem todas as catalases são proteínas de ligação à CaM. Assim, novas investigações são necessárias para abordar o Significado de Ca2+/CaM no controle da atividade da catalase em diferentes organelas.o aumento da AC2+ estimula a produção de H2O2, que se difunde em células circundantes como um mensageiro e induz a resposta fisiológica (19, 20). Os nossos resultados sugerem que o aumento da Ca2+ citosólica pode reduzir os níveis de H2O2 através da estimulação mediada por Ca2+/CaM da actividade da catalase (Fig. 4)., Propomos que o aumento da Ca2+ citosólica tem papéis duplos na regulação da homeostase H2O2(Fig. 6): (i) a regulação positiva gera H2O2 activando directamente a NADPH oxidase, que tem afinidade para Ca2+ (22) e produzindo indirectamente mais NADPH através da Ca2+/CaM-regulated NAD kinase (23); e (ii) a regulação negativa reduz a H2O2 estimulando a actividade da catalase através da modulação Ca2+/CaM (Fig. 4)., Mudanças induzidas pelo sinal em transientes Ca2+ podem diferir na frequência, duração, amplitude e localização espacial das oscilações, e modo de propagação espacial, o que leva a efeitos diferenciais nas proteínas alvo do cálcio (12, 44).
modelo que apresenta alterações desencadeadas com Ca2+que conduzem à regulação positiva e negativa do nível H2O2 nas plantas. Para regulação positiva, os sinais extracelulares desencadeiam um influxo de Ca2+, o que aumenta a geração de H2O2., Isto pode ocorrer ativando a NADPH oxidase, que tem afinidade com Ca2+, e aumentando a produção do NADPH por meio da cam-regulated NAD kinase. Para regulação negativa, Ca2+ liga-se à CaM, e o complexo Ca2+/CaM estimula a atividade catalítica da catalase, levando à rápida degradação de H2O2. O aumento do H2O2 pode aumentar o influxo de Ca2+ ativando o canal de cálcio.
