discussão
a coloração Gram é o procedimento de coloração mais utilizado na bacteriologia. É chamada de mancha diferencial, uma vez que diferencia entre bactérias Gram-positivas e Gram-negativas. As bactérias que mancha púrpura com o procedimento de coloração de Gram são denominadas Gram-positivo; aquelas que mancha rosa são ditas Gram-negativo. Os termos positivos e negativos não têm nada a ver com carga elétrica, mas simplesmente designam dois grupos morfológicos distintos de bactérias., as bactérias Gram-positivas e Gram-negativas apresentam uma coloração diferente devido às diferenças fundamentais na estrutura das suas paredes celulares. A parede celular bacteriana serve para dar ao organismo o seu tamanho e forma, bem como para prevenir a lise osmótica. O material na parede celular bacteriana que confere rigidez é o peptidoglicano.
em micrografos de electrões, a parede celular Gram-positiva aparece como uma parede densa de 20-80 nm de espessura e consiste em numerosas camadas interconectadas de peptidoglicano (figuras 1A e 1B). Quimicamente, 60 a 90% da parede celular Gram-positiva é peptidoglicano., Entrelaçados na parede celular do Gram-positivo são ácidos teicóicos. Ácidos teicóicos, que se estendem através e além do resto da parede celular, são compostos de polímeros de glicerol, fosfatos, e o açúcar álcool ribitol. Alguns têm um lipídico ligado (ácido lipoteicóico). A superfície exterior do peptidoglicano é studdded com proteínas que diferem com a estirpe e as espécies da bactéria.,a parede celular Gram-negativa, por outro lado, contém apenas 2 a 3 camadas de peptidoglicano e está rodeada por uma membrana exterior composta por fosfolípidos, lipopolissacarídeo, lipoproteína e proteínas (figuras 2A e 2B). Apenas 10% – 20% da parede celular Gram-negativa é peptidoglicano. Os fosfolípidos estão localizados principalmente na camada interna da membrana externa, assim como as lipoproteínas que ligam a membrana externa ao peptidoglicano., Os lipopolissacarídeos, localizados na camada exterior da membrana externa, consistem numa porção lipídica chamada lípido a embutido na membrana e uma porção polissacarídea estendendo-se para fora da superfície bacteriana. A membrana externa também contém uma série de proteínas que diferem com a estirpe e as espécies da bactéria.,
Para mais informações sobre as Gram-negativas e Gram-positivas parede celular, consulte os seguintes Objectos de Aprendizagem na sua Palestra Guia:
- O Procariontes Parede Celular; Unidade 1, Seção IIB2
- Gram-Positivos Parede Celular; Unidade 1, Seção IIB2a
- Gram-Negativa da Parede Celular; Unidade 1, Seção IIB2b
Gram a coloração de procedimento envolve quatro etapas básicas:
1. A bactéria é manchada pela primeira vez com o Corante Básico violeta cristal. Ambas as bactérias Gram-positivas e Gram-negativas ficam diretamente manchadas e aparecem roxas após este passo., 2. As bactérias são então tratadas com a solução de iodo de Gram. Isto permite que a mancha seja melhor retida, formando um complexo insolúvel de violeta-iodo cristal. Ambas as bactérias Gram-positivas e Gram-negativas permanecem roxas após este passo. 3. O descolorizador de Gram, uma mistura de álcool etílico e acetona, é então adicionado. Este é o passo diferencial. Bactérias Gram-positivas retêm o complexo Violeta-iodo cristal enquanto Gram-negativo são descolorizados. 4. Por último, aplica-se a contrastain safranina (também Corante Básico)., Uma vez que as bactérias Gram-positivas já estão manchadas púrpura, elas não são afetadas pela contrastain. Bactérias Gram-negativas, que são agora incolor, tornam-se diretamente manchadas por th e safranin. Assim, o Gram-positivo parece roxo, e o Gram-negativo parece rosa.
© Daniel Cavanaugh, Mark Keen, authors, Licensed for use, ASM MicrobeLibrary.,
With the current theory behind Gram staining, it is thought that in gram-positive bacteria, the crystal violet and iodo combinate to form a larger molecule that precipitates out within the cell. A mistura álcool / acetona provoca a desidratação do peptidoglicano Multicamadas, diminuindo assim o espaço entre as moléculas e fazendo com que a parede celular aprisione o complexo Violeta-iodo cristal dentro da célula., No caso de bactérias Gram-negativas, a mistura álcool/acetona, sendo um solvente lipídico, dissolve a membrana externa da parede celular e pode também danificar a membrana citoplasmática à qual o peptidoglicano Está ligado. As poucas camadas de peptidoglicano são incapazes de reter o complexo Violeta-iodo cristal e a célula é descolorada.
é importante notar que a gram-positividade (a capacidade de reter o complexo Violeta-iodo cristal roxo) não é um fenômeno todo ou nada, mas uma questão de grau., Existem vários fatores que podem resultar na coloração de um organismo Gram-positivo Gram-negativamente:
1. O método e as técnicas utilizadas. Sobreaquecimento durante a fixação do calor, sobre a descoloração com álcool, e até mesmo muita lavagem com água entre os degraus pode resultar em bactérias Gram-positivas perdendo o complexo Violeta-iodo cristal. 2. A era da cultura. Culturas com mais de 24 horas de idade podem perder a capacidade de reter o complexo de violeta-iodo cristal. 3. O próprio organismo., Algumas bactérias Gram-positivas são mais capazes de reter o complexo de violeta-iodo cristal do que outras.
portanto, deve-se usar técnicas muito precisas na coloração de Gram e interpretar os resultados com discrição.id = “81b9981d4e”> organismos
culturas de placas de ágar de soja de Escherichia coli (um pequeno bacillus Gram-negativo) e Staphylococcus epidermidis (um coccus Gram-positivo com um arranjo de staphylococcus).
procedimento (a ser feito individualmente)
1., Escherichia coli
A. Heat-fix a smear of Escherichia coli as follows:
1. Usando a garrafa de água desionizada do conta-gotas encontrada na sua prateleira de coloração, coloque 1/2 de uma gota de água de tamanho normal em um escorrega limpo, tocando o conta-gotas no escorrega (Figura 1). Altenately, usa o teu laço de inoculação esterilizado para colocar uma gota de água desionizada no escorrega. 2., Utilizando o seu ciclo de inoculação estéril, retire assepticamente uma pequena quantidade da cultura da superfície do ágar e toque – a suavemente 2 a 3 vezes na gota de água até que a água fique visivelmente turva (Figura 2). Uma boa mancha com a quantidade correta de bactérias é essencial para a coloração de Gram.
- muitas bactérias no slide podem resultar em sub-descoloração; muito poucas podem levar a sobre-descoloração.
3. Incinerar as bactérias restantes no circuito de inoculação., Se for adicionada demasiada cultura à água, não irá ver bactérias individuais manchadas e poderá não ter uma coloração de Gram fiável. 4. Após o ciclo de inoculação arrefece, espalha a suspensão por aproximadamente metade da lâmina para formar uma película fina. Uma mancha correctamente preparada com a quantidade certa de bactérias deve ser semelhante à Fig. 3. 5. Deixar secar completamente o ar com esta suspensão fina (Figura 4). O esfregaço deve estar completamente seco antes que o deslizamento seja fixado pelo calor!6., Para aquecer-fixar a bactéria ao escorrega, pegar no escorrega seco ao ar com pinças de cobertura e segurar a parte inferior do diapositivo em frente ao esfregaço perto da abertura do microincinerador durante 10 segundos (Figura 5), como demonstrado pelo seu instrutor. Se o escorrega não é aquecido o suficiente, todas as bactérias vão lavar-se. Se for sobreaquecido, a integridade estrutural da bactéria pode ser danificada. mancha com violeta cristal de Hucker durante um minuto (Figura 6). Lavar suavemente com água (Figura 7). Agitar o excesso de água, mas não secar entre os degraus.
C., Manchar com a solução de iodo de Gram durante um minuto (Figura 8) e lavar cuidadosamente com água.
D. Descolorize recolhendo o ‘slide’ e deixando o descolorizador da grama correr pelo ‘slide’ até que o roxo pare de fluir na parte inferior do ‘slide’ (Figura 9). certifique-se de que a totalidade do esfregaço está uniformemente descolorizada e que não está sub-descolorizado ou sobre-descolorizado.lave imediatamente com água.mancha com safranina durante um minuto (Figura 10)., Quando lavar o excesso de safranina, tenha muito cuidado para lavar suave e brevemente, pois é possível lavar parte do sarfanina na bactéria. secura da Mancha (Figura 11) e observação por microscopia de imersão em óleo.2. Staphylococcus epidermidis
um. Calor-correção de um esfregaço de Staphylococcus epidermidis da seguinte forma:
1. Usando a garrafa de água desionizada do conta-gotas encontrada na sua prateleira de coloração, coloque 1/2 de uma gota de água de tamanho normal em um escorrega limpo, tocando o conta-gotas no escorrega (Figura 1)., Altenately, usa o teu laço de inoculação esterilizado para colocar uma gota de água desionizada no escorrega. 2. Utilizando o seu ciclo de inoculação estéril, retire assepticamente uma pequena quantidade da cultura da superfície do ágar e toque – a suavemente 2 a 3 vezes na gota de água até que a água fique visivelmente turva (Figura 2).
- muitas bactérias no slide podem resultar em sub-descoloração; muito poucas podem levar a sobre-descoloração.
3. Incinerar as bactérias restantes no circuito de inoculação., Se for adicionada demasiada cultura à água, não irá ver bactérias individuais manchadas e poderá não ter uma coloração de Gram fiável. 4. Após o ciclo de inoculação arrefece, espalha a suspensão por aproximadamente metade da lâmina para formar uma película fina (Figura 3). 5. Deixar secar completamente o ar com esta suspensão fina (Figura 4). O esfregaço deve estar completamente seco antes que o deslizamento seja fixado pelo calor!6., Para aquecer-fixar a bactéria ao escorrega, pegar no escorrega seco ao ar com pinças de cobertura e segurar a parte inferior do diapositivo em frente ao esfregaço perto da abertura do microincinerador durante 10 segundos (Figura 5), como demonstrado pelo seu instrutor. Se o escorrega não é aquecido o suficiente, todas as bactérias vão lavar-se. Se for sobreaquecido, a integridade estrutural da bactéria pode ser danificada. mancha com violeta cristal de Hucker durante um minuto (Figura 6). Lavar suavemente com água (Figura 7). Agitar o excesso de água, mas não secar entre os degraus.
C., Manchar com a solução de iodo de Gram durante um minuto (Figura 8) e lavar cuidadosamente com água.
D. Descolorize recolhendo o ‘slide’ e deixando o descolorizador da grama correr pelo ‘slide’ até que o roxo pare de fluir na parte inferior do ‘slide’ (Figura 9). certifique-se de que a totalidade do esfregaço está uniformemente descolorizada e que não está sub-descolorizado ou sobre-descolorizado.lave imediatamente com água.mancha com safranina durante um minuto (Figura 10)., Quando lavar o excesso de safranina, tenha muito cuidado para lavar suave e brevemente, pois é possível lavar parte do sarfanina na bactéria. secar e observar usando microscopia de imersão em óleo.
3. Certifique-se de deitar cuidadosamente o corante usado na sua bandeja de coloração para o recipiente de recolha de resíduos de corante, não para baixo do lavatório.
© Hussein Shoeb, autor. Licenciado para uso, Microbelibrário ASM.
B., A coloração da cápsula
discussão
muitas bactérias secretam uma cobertura viscosa chamada cápsula ou glicocalix . Este é geralmente composto de polissacárido, polipeptido, ou ambos.
A capacidade de produzir uma cápsula é uma propriedade hereditária do organismo, mas a cápsula não é um componente celular absolutamente essencial. As cápsulas são frequentemente produzidas apenas em condições específicas de crescimento. Apesar de não ser essencial para a vida, cápsulas p robavelmente ajudar as bactérias a sobreviver na natureza., As cápsulas ajudam muitas bactérias patogénicas e normais da flora a inicialmente resistir a fagocitose pelas células fagocíticas do hospedeiro. No solo e na água, as cápsulas ajudam a evitar que as bactérias sejam engolidas por protozoários. As cápsulas também ajudam muitas bactérias a aderir às superfícies e, assim, resistir ao rubor. Também permite que muitas bactérias formem biofilmes. Um biofilme consiste em camadas de populações bacterianas aderindo às células hospedeiras e embutidas em uma massa capsular comum.,
Para mais informações sobre o bacterianas cápsulas, consulte os seguintes Objectos de Aprendizagem na sua Palestra Guia:
- O Glycocalyx (Cápsula) e S-Camada; Unidade 1, Seção IIB4a
- A Capacidade de Resistir a Fagocitárias Absorção; Unidade 3, Seção B5b
ORGANISMO
Leite Desnatado caldo de cultura de Enterobacter aerogenes. O leite magro fornece nutrientes essenciais para a produção de cápsulas e também fornece um fundo ligeiramente manchável.
procedimento (a ser feito individualmente)
1., Agite a cultura de caldo de leite com o seu laço e coloque 2-3 laços de Aerógenos Enterobacter numa lâmina de microscópio. 2. Usando o seu laço de inoculação, espalhar a amostra para cobrir cerca de uma polegada do slide. 3. Deixe secar completamente ao ar. Não conserta o calor. As cápsulas colam-se bem ao vidro e o calor pode destruir a cápsula. 4. Mancha com violeta de cristal por um minuto. 5. Lavar o excesso de corante com 20% de solução de sulfato de cobre. 6. Eliminar o excesso de sulfato de cobre e secar imediatamente.7. Observar usando microscopia de imersão em óleo., O organismo e o leite seco no escorrega irá pegar o corante roxo, enquanto a cápsula permanecerá incolor. 8. Certifique-se de deitar cuidadosamente o corante usado na sua bandeja de coloração para o recipiente de recolha de resíduos de corante, não para baixo do lavatório.9. Observe a coloração da cápsula de demonstração de Streptococcus lactis, uma bactéria encapsulada que é a flora normal no leite. a coloração Gram faz desenhos de cada bactéria na preparação da coloração Gram.,
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| Color = Gram reaction = Shape = |
Color = Gram reaction = Shape = Arrangement = |
B., A coloração da cápsula
faz um desenho da preparação da coloração da cápsula de Enterobacter aerogenes e da coloração da cápsula de demonstração de Streptococcus pneumoniae.
Cápsula mancha de
Streptococcus lactis
