é preciso um esforço real para manter o seu conhecimento básico de Biologia molecular e celular fresco, além de tudo o resto que você tem que fazer. Não seria ótimo se houvesse um lugar onde você pudesse encontrar artigos fáceis de ler que lhe permitam aperfeiçoar esses conceitos básicos em apenas alguns minutos?
… eu espero que você disse “sim”, porque este é o objetivo da minha série de” o básico: “série de artigos, que já temos, e continuará a, trazer para você periodicamente. Este artigo explica os fundamentos da ligação do ADN.,
o seu companheiro de ligação do ADN: ligase do ADN
ligase do ADN (EC 6.5.1.1) é a enzima no coração da reacção de ligação do ADN. Ele se junta covalentemente à espinha dorsal de fosfato de DNA com extremidades coesas contundentes ou compatíveis (ver Figura 1) e seu papel natural é na reparação de quebras de cadeia dupla em moléculas de DNA. Em Biologia molecular é comumente usado para a inserção de fragmentos de DNA gerados por enzimas de restrição em backbones vetoriais. Ligases comerciais são fornecidos com um tampão de reação contendo ATP e Mg2+, que são ambos essenciais para a atividade da ligase., Uma vez que a ATP pode ser danificada por ciclos repetidos de congelamento-degelo, é aconselhável fazer alíquotas do tampão (ver o meu artigo “pontas de ligação de ADN 5”).
Figura 1. Pontas coesas e contundentes, prontas para a ligação do ADN!
os dois passos da reação de ligação do DNA
a reação de ligação do DNA em si tem dois passos básicos. Em primeiro lugar, as extremidades do ADN têm de colidir por acaso e ficar juntas o tempo suficiente para que a ligase se junte a elas. Esta é a parte mais ineficiente da reação, mas é mais fácil a baixas temperaturas. Por quê?, Bem, como você provavelmente sabe, todas as moléculas se movem mais rápido em temperaturas mais elevadas, então você pode imaginar que vai ser mais fácil para duas DNA termina a colidir e ficar juntos se eles estão flutuando suavemente através da solução em temperatura baixa, em vez de voar sobre como eles seriam em altas temperaturas. Para fins coesos, há uma razão adicional; temperaturas mais baixas estabilizam a ligação de hidrogênio entre os nucleótidos complementares, o que realmente ajuda a manter as coisas no lugar.
Figura 2., Reacção enzimática da ligação do ADN
o segundo passo é a reacção enzimática, que é mostrada esquematicamente na Figura 2.. A ligase do ADN catalisa a ligação do 3′-OH ao 5′-fosfato através de um mecanismo de duas etapas. Em primeiro lugar, o nucleótido AMP, que está ligado a um resíduo de lisina no local ativo da enzima, é transferido para o 5′-fosfato. Então a ligação AMP-fosfato é atacada pelo 3 ‘ – OH, formando a ligação covalente e liberando AMP. Para permitir que a enzima proceda a outras reacções, o AMP no local activo da enzima deve ser reabastecido por ATP.,
aqui está a razão pela qual a ligação do ADN a baixas temperaturas pode ajudar
a enzima da ligase do ADN tem uma actividade óptima a 25°C, pelo que a reacção da ligação é realizada a uma temperatura que é um compromisso entre as temperaturas ideais para a aproximação do ADN (1°C) e a reacção enzimática (25°C). Normalmente 1hr a 16 ° C é bom, mas uma vez que reunir o DNA é a parte menos eficiente da reação favorável a isso, baixando a temperatura para 4°C pode dar ainda mais eficiência. No entanto, a enzima irá trabalhar muito lentamente a esta temperatura por um longo tempo (ex., durante a noite) o tempo de incubação é necessário.
originalmente publicado em 31 de outubro de 2007; Atualizado e republicado em 5 de dezembro de 2014.
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