amostras não tratadas. Notavelmente, observamos que, mesmo em amostras não manchadas, as diferenças entre a água e as gotículas de óleo (Fig. 1 B E C) ou entre diferentes constituintes da célula(Fig. 1D) gerar contraste suficiente para distingui-los. Nas células, materiais mais altos como sais, fósforo e ferro, que podem ser concentrados em diferentes regiões, tendem a melhorar o contraste. Figo., 1D mostra uma célula de ovário de hamster chinês (CHO) não tratada em meio de cultura normal à temperatura ambiente. O contorno celular e o núcleo com sua estrutura interna são claramente visíveis, assim como uma série de partículas escuras e esféricas no citoplasma. A identificação destas partículas como gotículas lipídicas é discutida abaixo.coloração de metais pesados. Os limites de resolução e contraste ao observar materiais de baixa Z sugerem que vantagens substanciais podem ser conseguidas através da coloração das células com marcadores de alta Z, tais como manchas densas de elétrons ou etiquetas de ouro de nanopartículas., Na verdade, somos capazes de detectar contas de ouro em água até um diâmetro de 10 nm usando membranas ultratin (dados não mostrados).a coloração diferencial das organelas no interior das células utilizando materiais de eletrondo é um padrão na técnica EM, embora não seja geralmente aplicado para SEM. Figo. 2 mostra uma rica variedade de estruturas dentro de células cultivadas que foram cultivadas diretamente na membrana de partição e, em seguida, fixo e manchado com acetato de uranilo (8). As organelas intracelulares são claramente visíveis, incluindo detalhes internos da mitocôndria(Fig. 2C ), actin stress fibers (Fig., 2D ) e estruturas tubulares e citoesqueléticas complexas (Fig. 2 A E B). A energia do feixe superior na Fig. 2C sondas a estrutura interna, enquanto que a energia mais baixa (Fig. 2D ), a superfície próxima à membrana é visualizada. Assim, diferentes energias podem ser usadas para obter informação tridimensional.Fig. 2. imagem de células manchadas . Asterisks denot nuclei, and thin arrows denot mitochondria. A) as células HeLa cultivadas na membrana em meio de crescimento normal, depois fixadas com paraformaldeído e manchadas com acetato de uranilo (imaginadas a 12 kV)., B) ampliação do rectângulo marcado indicado no ponto A. C) célula CHO fixada com glutaraldeído e paraformaldeído, manchada com acetato de uranilo e mantida em água (fotografada a 30 kV). A seta espessa indica uma mitocôndria que envolve uma gotícula lipídica. Ampliação superior mostrando mitocôndrias (setas finas). D) fibras de actina em células CHO manchadas. O tratamento e a imagem são os descritos para a.
Marcadores De Ouro de nanopartículas. Alta resolução e especificidade de detecção pode ser alcançada através da ligação de anticorpos ou outros ligantes., Como com outros métodos EM, a rotulagem é feita de forma mais conveniente usando nanopartículas de ouro. Em contraste com a transmissão em (MET), que mostra apenas seções muito finas e muitas vezes arbitrárias, wet SEM permite uma rápida troca entre a visão local e global de etiquetagem por toda a célula. Figo. 3 A E B mostram como anticorpos monoclonais antiepidérmicos do factor de crescimento monoclonal marcado com nanopartículas de 40 nm foram usados para rotular os receptores do factor de crescimento epidérmico em células cancerosas A431 intactas., Fixação é muitas vezes útil e conveniente, mesmo em sem molhado e pode facilitar a rotulagem, bem como a transferência para o microscópio. As células aqui apresentadas também são manchadas com acetato de uranilo, o que permite o alinhamento dos receptores rotulados com a estrutura geral das células. O alto contraste e o tamanho uniforme das nanopartículas permitem uma identificação e localização inequívocas. Conhecer a localização precisa de moléculas receptoras individuais abre a possibilidade de medir eventos como a dimerização do receptor induzida pelo fator de crescimento epidérmico., A coloração das células não é necessária para a rotulagem, e incluímos uma imagem de células não manchadas, rotuladas (Fig. 7, que é publicado como informação de apoio no site PNAS). Também é mostrada uma imagem demonstrando que a marcação das partes internas da célula é possível (Fig. 8, que é publicado como informação de apoio no site PNAS), neste caso, a marcação da mitocôndria com contas de ouro. A rotulagem dos filamentos de actina no interior das células também foi conseguida através do uso de partículas de ouro subnanómetro, seguidas de melhoria de prata (dados não apresentados).Fig. 3., imagem de marcadores de ouro de nanopartículas nas células. As pontas de flecha são nanopartículas de ouro. A) receptores do factor de crescimento epidérmico imunolabelados com nanopartículas de ouro de 40 nm em células A431 e contrastados com acetato de uranilo (com uma imagem de 30 kV). B) ampliação do rectângulo marcado indicado na E. C) receptores putativos de gastrina na bactéria H. pylori, após incubação com gastrina biotinilada complexada em partículas de ouro de 20 nm revestidas de estreptavidina, seguidas de glutaraldeído e sedimentação na membrana revestida de poli (l-lisina) (enjaulada a 20 kV).,
um exemplo de rotulagem de ouro em bactérias é dado na Fig. 3C . Aqui, o receptor putativo de gastrina do Helicobacter pylori (9) é detectado por incubação com complexos de gastrina biotinilada e nanopartículas de ouro de 20 nm revestidas com streptavidina. A administração da gastrina biotinilada antes da do ouro revestido com estreptavidina não produziu praticamente nenhuma ligação de nanopartículas à bactéria. Este resultado foi obtido independentemente do tempo entre as duas etapas, sugerindo que a captação de gastrina em H. pylori é quase imediata., O fato de que a gastrina complexada não entrou nas células aponta para a possibilidade de definir os limites do tamanho das partículas que podem ser internalizadas pela bactéria.comparação de técnicas de Imagiologia (Trypanosoma brucei). É útil comparar esta tecnologia com as técnicas de imagem existentes usando um único modelo de Sistema. Tal estudo é detalhado na Fig. 4, usando o parasita T. brucei forma procíclico que se propaga no meio da mosca tsé-tsé. As três primeiras imagens exibem modos de imagem existentes: microscopia óptica de fluorescência (Fig., 4A), microscopia de contraste de interferência diferencial (Fig. 4B ), e TEM (Fig. 4C ). A resistência das técnicas existentes é aparente: marcação localizada na fluorescência e secções detalhadas na met. A óptica não tratada (Fig. 4B ) e wet-SEM (Fig. 4D) as imagens delineiam as fronteiras da célula, mas são baixas em contraste e falta de detalhes. Ambos enfatizam o núcleo, mas outras organelas que aparecem na imagem de contraste de interferência diferencial não são claramente identificadas, enquanto a imagem wet-SEM traz as gotículas lipídicas para uma vantagem. Coloração do tetróxido de ósmio (Fig., 4E) não é tão útil neste sistema, enfatizando principalmente as gotículas lipídicas e algumas organelas internas não identificadas. A imagem mais forte é vista na Fig. 4F, para o qual foi usada coloração de acetato de uranilo. A vantagem da imagem intacta com a qual a célula completa pode ser vista (juntamente com suas estruturas internas finas que podem ser observadas em detalhes) é aparente, especialmente em comparação com a imagem met (Fig. 4C ). Por último, a imagem em forma húmida da marcação específica de células inteiras com anticorpos contra a principal proteína EP prociclin (10) da camada superficial ancorada na glicosilfosfatidilinositol, é mostrada na Fig., 4 G e H. Curiosamente, EP procyclin é conhecido por cobrir toda a célula uniformemente, mas o sinal observado é agrupado. Atribuímos isto à tendência das jangadas lipídicas subjacentes ao aglomerado sob a influência de anticorpos, um processo que a fixação em formaldeído é incapaz de prevenir. Os marcadores de ouro também elucidam a conformação tridimensional da célula de uma maneira que é reminiscente do que Padrão SEM Pode imagem (uma excelente, representativa Imagem SEM de T. brucei pode ser encontrada em http://tryps.rockefeller.edu/crosslab_intro.html).Fig. 4. imagem Multimodal de T. brucei., O comprimento típico de uma célula é de 20 µm de comprimento e 3 µm de largura. A) microscopia de fluorescência Confocal. Foram utilizados anticorpos anti-EP prociclina (Cedarlina) e a ligação foi detectada com anti-rato ligado ao isotiocianato de fluoresceína (verde). A coloração do núcleo e cinetoplast era com iodeto de propídio (vermelho). B) imagiologia óptica (contraste de interferência diferencial). (C) seções met de uma célula, seguido de coloração de acetato de uranilo, revelando organelas internas. D) imagiologia por via húmida de células inteiras, hidratadas e não encadeadas. E) tal como descrito para D utilizando coloração com tetróxido de ósmio., F) tal como descrito para D com coloração de acetato de uranilo. G) marcadores de ouro de nanopartículas ligados a anticorpos anti-rato, mostrando a localização da proteína de prociclina EP superficial e permitindo, ao mesmo tempo, uma visão tridimensional. H) ampliação mais elevada da secção média da célula apresentada em G, elucidando uma área de Helicidade tridimensional na célula.
Obviamente, TEM melhor resolução, em geral, do que molhado SEM, mas as imagens apresentadas no exemplo de T. brucei para comparação são “típicas” imagens obtidas no mesmo laboratório., Uma vez que o MET é diferente em sua utilidade do MET e microscopia óptica, em T. brucei pode ser visto como uma capacidade complementar importante, e pode-se esperar que a imagem completa seria dada por uma combinação de técnica ótica, Met e wet-SEM.secções dos tecidos. A SEM húmida pode ser utilizada em amostras espessas, como fragmentos de tecido, simplesmente montando a amostra contra a membrana. A profundidade de amostragem limitada de BSEs permite a imagem de uma” seção virtual”, estendendo-se da superfície para uma profundidade definida de até alguns micrômetros sem a necessidade de corte fino.,Fig. 5 A E B mostram a visualização direta de tecidos não tratados do rato. Figo. 5A é uma imagem de pequena ampliação do tecido cardíaco. A organização das células musculares é aparente. Zooming on one cell(Fig. 5B) dá uma visão vívida do núcleo e das organelas intracelulares, possivelmente mitocôndrias, e sua dispersão na célula. Como mostrado acima para células cultivadas, coloração de tecidos é vantajoso, mas não imperativo e pode melhorar a visualização de muitas características. Figo. 5 C E D mostram uma região do córtex renal de um rato., A coloração (ferricianeto de potássio) acentua a organização global e os contactos celulares no epitélio dos túbulos renais. Um ajuste cuidadoso das condições de coloração e imagem pode revelar informações diferentes e complementares, como arquitetura de tecidos; por exemplo, tecidos manchados com acetato de uranilo produzem uma imagem clara da matriz extracelular (dados não mostrados).Fig. 5. imagem de tecidos . A) coração de rato, não tratado, fotografado directamente no suporte da amostra a 30 kV. B) ampliação superior do rectângulo indicado em A., C) o rim de rato foi dissecado, cortado e fixado em formalina durante 24 h. O tecido foi então manchado com 0,1% de acetato de uranilo durante 10 minutos. C E D mostram células epiteliais dentro da superfície interna dos túbulos dos raios medulares. A grade que suporta a membrana é visível nesta imagem. D) ampliação da caixa indicada em C.
recolha simultânea de fotões (CL). A detecção de EEB em SEM húmida pode ser complementada pela recolha simultânea de fotões., O feixe de varrimento de elétrons excita moléculas na amostra, que então podem emitir luz em comprimentos de onda característicos (CL). A intensidade da luz, então, é usada para derivar uma imagem da distribuição de moléculas cintilantes, tanto endógenas para a célula como etiquetas que podem ser introduzidas de forma extrínseca. Esta imagem é obtida simultaneamente com a imagiologia pela EEB a uma resolução limitada por interações de matéria eletrônica e não por difração de luz (6). Inserimos um guia de luz no fluido por baixo da amostra, que guia a luz emitida para um fotomultiplicador., Esta configuração proporciona um bom acoplamento e uma eficiente coleta dos fótons excitados pelo feixe de elétrons, sem comprometer a eficiência da detecção concomitante de EEB.Fig. 6 mostra células CHO não tratadas, visualizadas simultaneamente pela EEB e fótons. Em Fig. 6A, as fronteiras celulares são claramente delineadas no modo de imagem eletrônica, e o núcleo (juntamente com seus nucleoli) são proeminentes, assim como as manchas escuras ≈1-µm em torno do núcleo. Estes aparecem no citoplasma de todas as células eucarióticas que investigamos, e apesar de seu número variar, eles geralmente são dispersos em torno do núcleo., Na imagem CL mostrada na Fig. 6B, o contorno celular e o núcleo são claramente definidos, indicando uma distribuição de moléculas cintilantes (semelhante à autofluorescência) na célula. Neste modo, os mesmos pontos são caracterizados por uma alta emissão de fótons. A combinação de um sinal catodoluminescente elevado e de elevado teor de carbono é típica de gotículas lipídicas (11), que participam no armazenamento de energia da célula (12)., Um teste independente de adição de ácido oleico de 200 µM causou uma forte proliferação destas gotículas na célula (dados não mostrados), consistente com a noção de que os pontos observados são gotículas lipídicas.Fig. 6. imagem simultânea com fótons retraídos e excitados por feixes de electrões (CL). (A) célula CHO não encadeada, obtida através da utilização de BSEs como descrito para a Fig. 1D . B) A imagem luminosa emitida em simultâneo com a que figura em A.,
Wet SEM tem uma vantagem sobre as técnicas padrão SEM na preservação de lípidos, especialmente em grandes agregados como gotículas lipídicas. Eliminar a necessidade de secagem salva os lípidos de solventes orgânicos que podem dissolvê-los. Embora o tratamento com ósmio preserve alguns bilayers lipídicos, em agregados maiores, o ósmio reage rapidamente para criar uma crosta externa que não deixa o ósmio entrar, deixando os agregados vulneráveis ao subsequente tratamento com solventes orgânicos., Em preparações criogênicas, a tendência do processo de clivagem para quebrar ao longo das fronteiras lipídicas–água é também um perigo para grandes estruturas lipídicas.
imagem de alta resolução de marcadores é uma capacidade altamente desejável do modo de detecção CL, requerendo o desenvolvimento de etiquetas para moléculas específicas em células. Em Fig. 9, que é publicado como informação de suporte no site PNAS, nós demonstramos que as contas fluorescentes padrão de 0,2 µm de diâmetro emitem fótons intensamente sob o feixe de elétrons e podem ser visualizadas com uma resolução de ≈100 nm (7)., Imagem de contas menores é limitada por baixo brilho, o que implica o desenvolvimento de contas especializadas de cintilação com pequeno diâmetro . Como o mecanismo de excitação da cintilação é mais forte quando o feixe está diretamente impingindo na conta, esperamos que isso possa estender a resolução da imagem fluorescente uma ordem de magnitude além da Disponível com microscopia óptica.
