Good Mood

Efeito de rbST em produção de leite

a Tabela 2 mostra um resumo da produção de leite para o rbST os grupos controle e expressos como média e desvio padrão da produção de leite (Kg / dia) em cada ciclo de tratamento, bem como produção de diferença entre os dois grupos (% de leite extra produzido pela rbST grupo em comparação ao controle de animais)., Do ciclo 0 ao ciclo 3, a produção de leite parece aumentar em ambos os grupos, indicando possivelmente que os animais ainda não tinham atingido o seu pico de lactação. Embora a primeira dose de rbST foi administrado em torno de 2 meses pós-parto, como recomendado pelo fabricante, é importante notar que esta recomendação é baseada em modelos matemáticos que localizam o pico de produção de leite em 60 a 90 dias após o parto., No entanto, estes modelos são apenas abordagens teóricas e os dias no leite (DIM) no pico do leite têm uma grande variação entre manadas e vacas, sendo condicionados, entre outros factores, pelo bem-estar e alimentação 37. Do ciclo 4 até ao final do estudo, vislumbrou-se uma diminuição na produção de leite de vacas de Controlo, enquanto os animais tratados com rbST pareciam manter a sua produção relativamente constante na média de 30-35 kg de leite por dia, mostrando uma tendência decrescente óbvia apenas quando o tratamento hormonal foi interrompido (ciclos 14, 15 e 16)., Neste momento, as diferenças de produção observadas entre os grupos voltaram a níveis muito próximos dos observados no ciclo 0. É notável o facto de a produção de leite ter sido significativamente mais elevada no grupo rbST do que no controlo durante todo o estudo, excepto durante o ciclo 6, quando estes animais estavam a produzir apenas 5% mais do que os sujeitos de controlo (Tabela 2). Com base no padrão de administração bi-semanal de rbST recomendado pelo fabricante, no dia 70 o grupo de animais tratados deveria ter recebido uma nova dose de hormona de crescimento recombinante., No entanto, essa dose não foi aplicada de modo a ser capaz de avaliar se o grupo rbST poderia recuperar o perfil de transcrição pré-dose após 28 dias sem administração hormonal (Fig. 1). Possivelmente devido a esta falta de hormônio, as diferenças estatisticamente significativas existentes na produção de leite entre os dois grupos desapareceram, destacando os efeitos da rbST sobre as taxas de produção de leite (Tabela 2). No dia 84, a rbST foi administrada novamente e as diferenças significativas na produção de leite entre os dois grupos reapareceram (24%)., No ciclo 12, observou-se uma diferença máxima de 43% mais leite em animais tratados no que respeita às vacas de controlo, ambas relacionadas com uma produção mantida devido à rbST e um padrão natural decrescente nas fêmeas de controlo. Curiosamente, estas diferenças significativas mantiveram-se até ao final do estudo, mesmo quase dois meses após a administração da última dose (12.a dose, dia 168) (Tabela 2).

isolamento de RNA de bovinos células somáticas

MSCs são fáceis de coletar fonte de RNA para o gene estudos de expressão, como essas células podem ser isoladas a partir de leite cru após um protocolo simples. Além disso, a recolha de amostras é barata e não invasiva, uma vez que o leite pode ser recolhido na sala de ordenha sem contacto directo com o animal e, portanto, sem causar stress para ele, o que poderia alterar os resultados obtidos. Neste estudo, o tratamento com rbST não teve efeito significativo (P = 0.,099) on the quantity of RNA isolated from MSCs, with a mean concentration of 120,69 ± 68,31 µg mL−1 in samples from the rbST group and 132,36 ± 68,86 µg mL−1 in samples from the control group. O valor médio da razão A260/280 foi de 1, 766 ± 0, 095. É possível que um passo de purificação com colunas de spin tenha aumentado a razão A260/280 e, portanto, a pureza das amostras de ARN. Embora a inclusão desta etapa aumente o preço da amostra na análise de rotina, permite obter amostras com maior pureza. O valor RIN médio observado para as amostras analisadas foi de 6,88 ± 0.,82 alguns factores podem afectar a integridade das amostras. As amostras utilizadas neste estudo eram células somáticas bovinas isoladas do leite. O leite é caracterizado por um microbiota complexo e RNases derivadas desse microbiota podem ser responsáveis por uma menor integridade do RNA. Além disso, algumas das células somáticas presentes no leite podem ser parcialmente degradadas. Estes fatos também foram observados em um estudo que utilizou esfregaço vaginal bovino para estudos de transcriptomia com o objetivo de encontrar biomarcadores para rastrear o uso indevido de agentes38 anabolizantes., Além disso, o processo de ordenha, coleta de leite e transporte para o laboratório pode, apesar de ser realizado com a maior rapidez possível, afetar a integridade do RNA.

efeito da rbST nos genes do eixo somatotrópico

foi seleccionado um conjunto de 18 genes (Quadro 1) para desenhar as placas OpenArray® utilizadas neste estudo. Esta seleção foi baseada no potencial destes genes para obter uma assinatura transcriptômica rBST característica que poderia ser usado como um padrão para controlar a ab(uso) de rbST em gado leiteiro., Estudos anteriores de expressão genética com rbST foram concebidos como estudos de amostragem única e única em tecidos mamários post mortem27 ou em estudos de dose múltipla (cinco doses) com amostragem sanguínea e muscular em vivo31. Estes métodos são considerados invasivos, relativamente dispendiosos e, por conseguinte, impraticáveis para efeitos de controlo em explorações leiteiras. No caso da somatotropina, o controle deve ser realizado in vivo, uma vez que o objetivo final é evitar a entrada de leite de rbST no mercado leiteiro.,

neste estudo, a expressão de IGF-1 só foi detectada em todos os pontos de amostra de uma vaca (vaca 7) tratada com rbST e não foi detectável no MSCs do grupo de controlo. O fato de que só foi possível detectar o alvo IGF-1 em todos os pontos de amostra de uma vaca pode indicar a existência de diferentes respostas da glândula mamária local para o rbST exógeno entre os indivíduos. A maioria das moléculas de IGF-1 encontradas na circulação estão ligadas com elevada afinidade a uma ou mais das seis proteínas de ligação IGF-1 conhecidas (IGFBP-1–6) que modulam a biodisponibilidade do IGF-1 nos tecidos-alvo 39., Estudos anteriores observaram que a rbST influencia fortemente a regulamentação do IGFBP-5 no músculo esquelético do cattle31 e o IGFBP-3 no tecido mamário 32. No entanto, neste estudo, transcrições de nem IGFBP-3 nem IGFBP-5 foram detectadas em qualquer momento. Este resultado pode ser devido ao MSCs ser composto principalmente de leucocites40 em que o efeito repressivo do IGFBP pode não ser tão importante como no tecido mamário. Assim, neste estudo, tanto as proteínas de ligação IGF-1 como IGF-1 são descartadas como marcadores potenciais em células somáticas.,

outro componente chave do eixo somatotrópico é o receptor IGF-1 (IGF-1R) que é o principal receptor de sinalização para IGF-1 que Media a maioria dos seus efeitos biológicos. No dia 1 o rbST (grupo de 0.348 ± 0.131) tiveram significativamente (P < 0.001) maior abundância relativa de IGF-1R que o grupo de controle (0.0898 ± 0.0486). Diferentes estudos que avaliaram a concentração de rbST no sangue após a administração observaram que as concentrações mais elevadas desta hormona recombinante foram encontradas após a administração de rbst14, 15., Por conseguinte, as diferenças significativas observadas no grupo tratado podem ser devidas como Resposta ao IGF-1 sintetizado como Resposta às concentrações mais elevadas de rbST em vacas tratadas após a administração da primeira dose. Em Fig. 2, pode-se observar que a abundância relativa de IGF-1R para os dois primeiros ciclos de administração de rbST também foi significativamente maior no grupo rbST do que no grupo controle em muitos pontos de amostra. Curiosamente, no dia 84 do estudo, a abundância relativa de IGF-1R foi semelhante no grupo rbST (0.070 ± 0.057) e no grupo controle (0.110 ± 0.030)., Este dia coincidiu com a sexta administração de rbST, e entre esta dose e a quinta dose houve um intervalo de 28 dias em vez de 14 dias. Portanto, é possível que o grupo rbST tenha recuperado o nível fisiológico de IGF-1R após vários dias sem rbST, mostrando até mesmo efeitos de abstinência na transcrição IGF-1R. Estes resultados indicam que o IGF-1R é um possível bom candidato para inclusão em um painel de genes para detectar o uso de rbST em fazendas de laticínios., Embora outros autores não tenham encontrado um efeito significativo da rbST nos níveis de IGF-1R no músculo esqueletal31, neste estudo foi observada uma resposta clara nos níveis desta transcrição receptora no MSCs. Neste sentido, os leucócitos,neutrófilos e monócitos podem produzir hormona do crescimento e IGF-1 e expressar os seus receptores que indicam que as vias de sinalização IGF-1/IGF-1R podem exercer funções reguladoras no sistema imunitário, incluindo a proliferação das células imunes41, 42. A diferença entre os dois estudos pode ser devida às diferentes matrizes utilizadas., MSCs poderia responder melhor aos mais altos níveis circulantes de IGF-1 e aumentar o número de receptores para esta molécula em sua membrana

Efeito de rbST no sistema imunológico-genes relacionados

o factor de necrose Tumoral (TNF) e interleucina-1β (IL-1β) são duas citocinas intimamente relacionado com imunológico system43., Devido presumivelmente à sua relação, foi possível identificar tendências semelhantes na abundância relativa de transcrições TNF e IL-1β ao longo do estudo. A administração rbST provocou um aumento significativo na abundância relativa de transcrições TNF e IL-1β. Vale ressaltar que nos dias 9, 23 e 35, a abundância relativa de TNF e IL-1β era significativamente maior no grupo rbST em comparação com o grupo controle (Fig. 3). Estes dias correspondem à segunda semana de ciclos de rbST, aproximadamente 7-9 dias após injecções de Lactotropina®., Portanto, é possível que as mudanças transcriptômicas causadas por rbST nestas duas citoquinas sejam mais evidentes na segunda semana de um ciclo de rbST. Curiosamente, no dia 84 (28 dias após a 5ª administração rbST), não houve diferenças significativas entre os grupos (Fig. 3). Neste contexto, outros estudos anteriores têm usado poderosas tecnologias transcriptômicas para detectar o uso de agentes anabólicos em cattle26,38., Estes estudos também observaram um aumento da transcrição de IL-1β, um deles significativamente26, e isto é muito interessante porque o estudo referido utilizou células sanguíneas que a composição é muito semelhante à dos MSCs, uma vez que têm uma elevada proporção de glóbulos brancos. No entanto, os estudos anteriormente mencionados não encontraram um efeito de agentes anabólicos no TNF, enquanto a presente pesquisa encontrou uma forte influência da administração do rbST na abundância relativa do TNF., A este respeito, tem sido relatado que a administração exógena de rbST durante o aleitamento pode aumentar a resposta imunitária em cows44. Na verdade, as contagens de células somáticas do leite aumentaram mais cedo e mais depressa em vacas que sofriam de mastite de coliformes quando a rbST foi administrada 45. A hormona do crescimento e a sua versão recombinante mostram a capacidade de modular a reacção inflamatória e a defesa neutrofílica da glândula mamária lactante bovina na saúde e nas vacas doentes 45. Isto poderia explicar o aumento do regulamento TNF e IL-1β em vacas tratadas com rbST.,é muito difícil encontrar um gene específico que possa ser usado como gene muito confiável em estudos de rastreio usando transcriptômica. Note-se que tanto a IL-1β como o TNF podem ser regulados em outros processos como mastite sub-clínica 46,47. Diversos estudos realizados nos Estados Unidos observaram que as grandes explorações agrícolas são mais propensas a adoptar a rbST, sugerindo não só uma potencial componente de dimensão da exploração da utilização e rentabilidade da rbST,mas também uma componente de operador (idade e educação) 48, 49., A somatotropina recombinante tem sido frequentemente notificada como uma tecnologia de gestão intensiva, associada ao uso de outras tecnologias orientadas para a produtividade e práticas de gestão que são características de explorações maiores, sendo menos frequente entre os grazers49,50. Neste sentido, a mastite subclínica provoca uma redução da produção de leite nas vacas afectadas 51. Por conseguinte, deve ser interessante combinar os dados dos ensaios transcriptómicos com os dados relativos à produção de leite., Também pode ser acompanhado por um teste microbiológico de leite de vacas suspeitas para detectar os principais agentes patogénicos associados à mastite subclínica. Mas o que realmente aumenta o potencial de discriminação é a inclusão de mais genes no painel.

Efeito de rbST no ciclo celular, proliferação, diferenciação e adesão

por Isso, é saber que rbST aumenta a síntese do leite, aumentando o volume de negócios (proliferação/apoptose) e a atividade das células epiteliais mamárias, indicando que rbST influências vias metabólicas que regulam o volume de negócios de célula/ciclo e metabolism52., O ciclo celular é controlado por ciclinas e cinases dependentes de ciclinas. Destes, a ciclina D (endodada pelo gene CCND1) coordena a progressão do ciclo celular através da estimulação extracelular (por exemplo, factor de crescimento, disponibilidade de nutrientes) e conduz a progressão da fase G1 para S, resultando em mitose celular. No entanto, a maioria das células adultas são mantidas num estado quiescente conhecido como fase G0, um estado de repouso, e podem reentrar no ciclo celular na fase G1 sob um estímulo mitogénico apropriado. Neste estudo, observou-se que o tratamento com rbST influencia fortemente a transcrição CCND1., Antes da primeira dose de rbST, não havia diferenças significativas entre os grupos controle e rbST (Fig. 3). No entanto, após a primeira dose, foi possível observar diferenças significativas entre os dois grupos em pontos de amostra diferentes. A abundância relativa de CCND1 foi significativamente maior no grupo rbST do que no grupo controle nos dois primeiros ciclos do tratamento rbST (Fig. 2). Este efeito parece ser particularmente evidente 9 dias após a administração da rbST, da mesma forma que as transcrições TNF e IL-1β., Assim, nos dias 9, 23 e 35 do estudo, a abundância relativa de CCND1 foi significativamente maior no grupo rbST do que no grupo controle (Fig. 3). Finalmente, no dia 84 (28 dias após a 5ª administração rbST), não houve diferenças significativas entre os grupos (Fig. 3) como no caso das citocinas. Também, no último dia (219) de amostragem (51 dias após o último rbST doses), não houve diferenças significativas (P > 0,05) entre o rbST grupo (0.433 ± 0.141) e o grupo controle (0.430 ± 0.178)., Portanto, a administração exógena de rbST causa uma sobre-expressão de CCND1. Isto pode resultar na ativação de células na fase G0, e no caso particular de tecidos mamários, um aumento na produção de leite através do aumento do número de células alveolares de gland54 mamária.outros genes relacionados com o ciclo celular são proteínas tumorais do tipo 2 (TPD52L2) e sirtuina 2 (SIRT2). De uma forma semelhante à observada para CCND1, TNF e IL-1β, foi possível encontrar uma abundância relativa de transcrições SIRT2 no grupo rbST (1.,517 ± 0, 199) do que no grupo de controlo (0, 506 ± 0, 250) no dia 23 do estudo, mas neste caso apenas durante o segundo ciclo de administração da rbST (Fig. 4). O aumento dos níveis de transcrições CCND1 e SIRT2 após a segunda administração de Lactotropina® no grupo tratado pode ser o resultado de um efeito de rbST exógeno no ciclo celular. A circulação desta hormona peptídica no organismo resultaria na activação do ciclo celular nas células alvo., No entanto, nos outros ciclos rbST, a relação entre a administração de dose e as alterações na abundância relativa de transcrições SIRT2 não foi tão evidente como na segunda dose. Além do que precede, é notável que o grupo tratado apresentou uma abundância relativa significativamente maior de transcrições TPD52L2 (P < 0,05) durante 4 dias após a primeira administração rbST. Outra componente implicada no metabolismo celular pelo seu papel relevante na tradução é o Fator de alongamento eucariótico 1 Gama (EEF1G).,

neste estudo, a abundância relativa de transcrições EEF1G não seguiu uma tendência óbvia relacionada com a administração de rbST., No entanto, nos dias 17 e 30 (3 e 2 dias após a segunda e terceira doses de rbST, respectivamente), a abundância relativa de transcrições EEF1G foi significativamente maior no grupo rbST. Um estudo anterior27 concluiu que o tratamento com rbST aumenta os níveis de transcrições de EEF1G em tecidos mamários, mas apenas utilizou um ponto de Amostragem 6 dias após a administração de somatotropina. Portanto, não é possível comparar diretamente esses resultados com os resultados obtidos neste estudo, no qual foram utilizados 36 Pontos de amostra para ensaios transcriptômicos ao longo de 8 meses., Outro gene incluído neste estudo é a globula de gordura láctea-proteína do fator 8 do FEG (MFGE8). Em Fig. 4, é possível observar que a abundância relativa de MFGE8 no grupo rbST teve grande variabilidade entre os dias de amostragem. Em particular, McCoard et al.27 observou que 6 dias após a administração do rbST, a abundância relativa de MFGE8 no tecido mamário bovino era maior. No entanto, como mencionado anteriormente, esse estudo incluiu apenas um ponto de dados após uma única dose de rbST., O presente experimento de dose múltipla a longo prazo demonstrou que os padrões de transcrição em bovinos tratados com rbST têm grande variabilidade ao longo do tempo. Por exemplo, os dados obtidos para CCND1 mostraram que o efeito de rbST na transcrição de alguns genes aumenta com o número de doses. Embora seja possível que a rbST influencie a transcrição do gene MFGE8, os resultados obtidos mostraram a regulação tanto para cima como para baixo., Portanto, o MFGE8 não pode ser sugerido como um candidato ideal para rastrear o uso de rbST (ab)em bovinos, uma vez que não foi possível observar uma clara tendência em sua transcrição. Outro gene relacionado com a adesão celular avaliado neste estudo é a catenina Alfa-like 1 (CTNNAL1). No entanto, não foi possível encontrar diferenças significativas na sua transcrição como resultado da administração de rbST.

outros genes

lactoferrina (LTF) é uma glicoproteína que liga o ferro pertencente à família transferrina 55., A figura 4 mostra a evolução da abundância relativa do gene LTF em todos os pontos de amostra avaliados neste estudo. Embora tenha sido observada uma melhoria da regulação do LTF em estudos anteriores com substâncias anabólicas em cattle38, não foi possível estabelecer uma clara tendência para o LTF em relação ao tratamento com rbST. Por exemplo, nos dias 9 e 53, a abundância relativa de LTF é consideravelmente menor nos animais tratados com rbST. No entanto, no dia 91, a abundância relativa era consideravelmente maior naquele grupo. É necessário discutir os resultados obtidos para o gene colagénio tipo III α 1 (COL3A1)., Um estudo anterior concluiu que os tratamentos com rbST em bovinos leiteiros causam a regulação do gene COL3A1 no tecido mamário 6 dias após a administração da rbst27. No entanto, no presente trabalho não foi possível detectar transcrições do gene COL3A1. Também a transcrição do ESR2 não foi detectada neste estudo.

Um painel de genes para o monitor de rbST (ab)uso em bovinos de leite

O objetivo final deste trabalho foi propor uma rotina painel de genes cuja combinado transcrição padrão seria permitir o desenvolvimento de um método de triagem para controlar o uso indevido de rbST em fazendas de leite através de MSCs., Ao contrário de outros estudos anteriores 27, 31, 32, Este trabalho analisou os padrões de transcrição de genes relacionados com o rbST em um experimento de condições reais de 8 meses, incluindo 12 ciclos de administração e controle de animais. Esta abordagem permitiu obter dados mais precisos a fim de diferenciar entre vacas tratadas com rbST e vacas de controlo.

a análise estatística multivariada foi realizada para elucidar modificações nos padrões de transcrição MSCs como consequência da administração de rbST., Para este efeito, apenas a transcrição dos nove genes que foram medidos ao longo de todo o experimento (IGF1R, CCND1, TNF, IL1ß, SIRT2, EEFG1, MFEG8, LTF, TDP52L2) foram utilizados, excluindo aqueles genes que apenas se expressa em muito poucos casos/exemplos. O principal objetivo da análise PCA é identificar padrões globais em dados, detectando a correlação entre diferentes variáveis, ou seja, neste caso particular, transcrições de diferentes genes., A projeção das amostras para o novo espaço multidimensional dos principais componentes (PCs) permitiria potencialmente uma diferenciação entre rbST e grupos de controle, destacando também os genes com maior capacidade como biomarcadores do tratamento. Na parcela de Pontuação da análise PCA apresentada na Fig. 5, uma tendência de agrupamento pôde ser vislumbrada nos dois grupos de amostras MSC, com animais tratados com rbST identificados como círculos vermelhos e animais de controlo como caixas negras, e rotulados de acordo com o dia experimental., Várias amostras de rbST grupo apareceu misturado com controles no lado esquerdo do gráfico, mas, curiosamente, a maioria delas corresponde a um dia de somatotropina de administração (dias 14, 28, 57 84) ou para os primeiros 2-3 dias após uma dose (dias 2, 3, 17, 44 ou 115), em que uma evidente transcriptomic perturbação não foi detectado. Pelo contrário, muito poucos animais de controlo poderiam ser classificados como vacas tratadas no APC, e a sua situação é explicada por valores extremos, em especial genes pouco discriminativos, tais como LTF, MFGE8 ou SIRT2.,

os perfis transcriptómicos foram também submetidos a uma OPLS-DA, a partir da qual foram também apontados genes discriminativos potenciais. Em Fig. 6a, a representação visual do modelo multivariato é mostrada, com amostras MSC de animais de controlo plotados como quadrados negros e amostras do grupo rbST como círculos vermelhos. De forma semelhante ao PCA, várias amostras de rbST são projetadas entre amostras de controle no lado esquerdo da elipse., No entanto, essas amostras foram coletadas quando a perturbação transcriptômica causada por rbST tinha desaparecido (ou não tinha aparecido ainda), tão estritamente, que poderiam ser classificados como controles naquele momento específico. Inversamente, muito poucas amostras de controle foram mal classificadas como rbST. Quando não está disponível nenhum conjunto de testes como é o caso aqui, o método de validação cruzada é a principal estratégia para avaliar a qualidade de um modelo. Os resultados do procedimento de validação cruzada são resumidos pelo valor de diferentes parâmetros de qualidade., Neste estudo, o modelo MULTIVARIATO OPLS mostrou as seguintes características: R2 ( X) = 0, 6, R2(Y) = 0, 4 e Q2 = 0, 3. O modelo explica 60% da variação no x-espaço e 40% da variação no y-espaço, e a bondade da previsão é de 30%. Estes valores indicam uma descrição relativamente boa dos dados pelo modelo e a previsibilidade média 34. O valor p calculado a partir da CV-ANOVA foi de 3,01 × 10-7, sugerindo a existência de diferenças significativas entre as duas classes do modelo., O fato de que este modelo foi construído com um painel de genes com diferentes habilidades discriminatórias não deve ser ignorado, uma vez que afeta o poder discriminante dos OPLS. Além disso, aqueles dias experimentais com muito pouco ou nenhum efeito rbST em suas transcrições estão definitivamente distorcendo o modelo, uma vez que na prática eles pertencem a um grupo, mas agir como o outro., Em futuros modelos multivariados de triagem, um painel de genes altamente discriminativos selecionados deve ser usado, e de preferência, amostras” conhecidas” e “desconhecidas” a serem projetadas no modelo multivariado pertencerão a populações semelhantes (idade, raça, etc.) e momentos de lactação, numa tentativa de ultrapassar a variabilidade35. Neste tipo de abordagens, também é importante que a população preditiva seja maior do que as amostras previstas. Por último, as razões da discriminação no OPLS-DA foram investigadas na s-plot correspondente (Fig., 6b), que revelou a contribuição de cada variável (transcrição genética) para a separação das duas classes de amostra. Como comentado em secções anteriores, a transcrição mais discriminante na MSC foi encontrada nos genes CCND1, IGF-1R, TNF e IL-1β. Parece claro que os tratamentos rbST desencadeiam uma regulação desses genes e a sua utilização em futuros painéis de monitorização é uma opção promissora para o controlo de rotina no sector leiteiro.,

Como em um controle de rotina para detectar o uso ilícito de rbST com este gene painel, não haveria nenhuma informação sobre quando as vacas foram tratadas (em outras palavras, é um cego ensaio), de preferência todos os dias durante a lactação deve ser amostrado/controlado. No entanto, do ponto de vista prático, esta sugestão parece um pouco irrealista. O que é proposto é uma recolha aleatória de leite uma vez por semana, alternando dias de semana., Uma vez que a somatotropina é administrada regularmente durante todo o aleitamento (a partir de 80-100 dias após o parto, duas vezes por semana), em todas as vacas em lactação da exploração, com um bom plano de amostragem, a dada altura a rbST deve ser detectada na exploração. Os dados transcriptómicos obtidos a partir das amostras recolhidas têm de ser comparados com um conjunto de dados transcriptómicos de uma população de controlo. As amostras que apresentaram valores mais elevados de genes propostos neste artigo devem ser consideradas suspeitas. O segundo passo deve ser investigar a situação particular de cada vaca “positiva” (mastite, gravidez, etc.,), e, se necessário, continuar a análise de confirmação. É importante destacar também as capacidades de alta produção desta abordagem de PCR em tempo real, tornando possível o plano de amostragem.