Good Mood

Ergebnisse

Unbehandelte Proben. Insbesondere beobachten wir, dass selbst bei ungefärbten Proben die Unterschiede zwischen Wasser-und Öltröpfchen (Abb. 1 B und C) oder zwischen verschiedenen Bestandteilen der Zelle (Abb. 1D) ausreichend Kontrast erzeugen, um sie zu unterscheiden. In Zellen neigen höherwertige Materialien wie Salze, Phosphor und Eisen, die in verschiedenen Regionen konzentriert sein können, dazu, den Kontrast zu verbessern. Abb., 1D zeigt eine unbehandelte chinesische Hamster-Eierstockzelle (CHO) in normalem Kulturmedium bei Raumtemperatur. Der Zellumriss und der Kern mit seiner inneren Struktur sind deutlich sichtbar, ebenso wie eine Reihe dunkler, kugelförmiger Partikel im Zytoplasma. Die Identifizierung dieser Partikel als Lipidtröpfchen wird im Folgenden diskutiert.

Schwermetallfärbung. Die Grenzen für Auflösung und Kontrast bei der Beobachtung von Low-Z-Materialien legen nahe, dass wesentliche Vorteile durch Anfärben der Zellen mit High-Z-Markern wie elektronendichten Flecken oder Nanopartikelgoldetiketten erzielt werden können., In der Tat können wir Goldperlen in Wasser bis zu einem Durchmesser von 10 nm mithilfe ultradünner Membranen nachweisen (Daten nicht gezeigt).

Die Differentialfärbung von Organellen innerhalb von Zellen unter Verwendung von Elektrondense-Materialien ist ein Standard in der EM-Technik, obwohl sie normalerweise nicht für SEM angewendet wird. Abb. 2 zeigt eine Vielzahl von Strukturen innerhalb von kultivierten Zellen, die direkt auf der Trennmembran gezüchtet und dann mit Uranylacetat fixiert und gefärbt wurden (8). Intrazelluläre Organellen sind deutlich sichtbar, einschließlich der inneren Details der Mitochondrien (Abb. 2C ), Aktin-Stressfasern (Abb., 2D) und komplexe tubuläre und zytoskeletale Strukturen (Abb. 2 A und B ). Die höhere Strahlenergie in Fig. 2C Sonden interne Struktur, während bei niedrigerer Energie (Abb. 2D) wird die membrannahe Oberfläche visualisiert. Somit können verschiedene Energien verwendet werden, um dreidimensionale Informationen zu erhalten.

Gold-Nanopartikel-Marker. Eine hohe Auflösung und Spezifität des Nachweises kann durch Bindung von Antikörpern oder anderen Liganden erreicht werden., Wie bei anderen EM-Methoden erfolgt die Kennzeichnung am bequemsten unter Verwendung von Goldnanopartikeln. Im Gegensatz zu Transmission EM (TEM), die nur sehr dünne und oft beliebige Abschnitte abtastet, ermöglicht Wet SEM einen schnellen Wechsel zwischen der lokalen und globalen Sicht der Beschriftung in der gesamten Zelle. Abb. 3 A und B zeigen, wie 40-nm-Nanopartikel-goldmarkierte monoklonale antiepidermale Wachstumsfaktor-Rezeptor-Antikörper zur Markierung der epidermalen Wachstumsfaktor-Rezeptoren auf intakten A431-Krebszellen verwendet wurden., Fixierung ist oft nützlich und bequem auch in nassem SEM und kann die Kennzeichnung sowie die Übertragung auf das Mikroskop erleichtern. Die hier vorgestellten Zellen sind ebenfalls mit Uranylacetat gefärbt, was eine Ausrichtung der markierten Rezeptoren auf die allgemeine Struktur der Zellen ermöglicht. Der hohe Kontrast und die gleichmäßige Größe der Nanopartikel ermöglichen eine eindeutige Identifizierung und Lokalisierung. Die Kenntnis der genauen Lokalisierung einzelner Rezeptormoleküle eröffnet die Möglichkeit, Ereignisse wie die epidermale Wachstumsfaktor-induzierte Rezeptordimerisierung zu messen., Die Färbung der Zellen wird für die Kennzeichnung nicht benötigt, und wir haben ein Bild von nicht gefärbten, markierten Zellen aufgenommen (Abb. 7, die als unterstützende Informationen auf der PNAS-Website veröffentlicht wird). Ebenfalls gezeigt ist ein Bild, das zeigt, dass eine Markierung von inneren Teilen der Zelle möglich ist (Abb. 8, die als unterstützende Informationen auf der PNAS-Website veröffentlicht wird), in diesem Fall die Markierung von Mitochondrien mit Goldperlen. Die Markierung von Aktinfilamenten innerhalb von Zellen wurde ebenfalls unter Verwendung von Subnanometer-Goldpartikeln erreicht, gefolgt von einer Silberverstärkung (Daten nicht gezeigt).

Ein Beispiel für die Goldmarkierung von Bakterien ist in Abb. 3C . Hier wird der mutmaßliche Gastrin-Rezeptor von Helicobacter pylori (9) durch Inkubation mit Komplexen von biotinyliertem Gastrin und Streptavidin-beschichteten 20-nm-Goldnanopartikeln nachgewiesen. Die Verabreichung des biotinylierten Gastrin vor der Verabreichung des Streptavidin-beschichteten Goldes ergab fast keine Anhaftung von Nanopartikeln an das Bakterium. Dieses Ergebnis wurde unabhängig von der Zeit zwischen den beiden Schritten erhalten, was darauf hindeutet, dass die Aufnahme von Gastrin in H. pylori fast unmittelbar erfolgt., Die Tatsache, dass komplexes Gastrin nicht in die Zellen gelangt ist, weist auf die Möglichkeit hin, die Grenzen der Partikelgröße zu definieren, die von den Bakterien verinnerlicht werden können.

Vergleich von bildgebenden Verfahren (Trypanosoma brucei). Es ist nützlich, diese Technologie mit vorhandenen Bildgebungstechniken unter Verwendung eines Einmodellsystems zu vergleichen. Eine solche Studie ist in Abb. 4, mit dem Parasiten T. brucei prozyklische Form, die sich im Mittelfinger der Tsetse-Fliege ausbreitet. Die ersten drei Bilder zeigen vorhandene Bildgebungsarten: optische Fluoreszenzmikroskopie (Abb., 4A ), differentielle Interferenzkontrastmikroskopie (Abb. 4B ) und TEM (Abb. 4C ). Die Stärke bestehender Techniken ist offensichtlich: lokalisierte Markierung in Fluoreszenz und detaillierte Abschnitte in TEM. Die unbehandelte Optik (Abb. 4B) und Wet-SEM (Abb. 4D) bilder definieren die Ränder der Zelle, sind jedoch kontrastarm und detailarm. Beide betonen den Kern, aber andere Organellen, die im differentiellen Interferenzkontrastbild erscheinen, sind nicht eindeutig identifiziert, während das Wet-SEM-Bild die Lipidtröpfchen zu einem Vorteil bringt. Osmium-Tetroxid-Färbung (Abb., 4E) ist in diesem System nicht so nützlich und betont hauptsächlich die Lipidtröpfchen und einige nicht identifizierte innere Organellen. Die stärkste Abbildung ist in Abb. 4F, für die Uranylacetatfärbung verwendet wurde. Der Vorteil der intakten Bildgebung, mit der die volle Zelle gesehen werden kann (zusammen mit ihren feinen inneren Strukturen, die im Detail beobachtet werden können), zeigt sich insbesondere im Vergleich zur TEM-Bildgebung (Abb. 4C ). Schließlich ist die Nass-SEM-Bildgebung der ganzzell-spezifischen Markierung mit Antikörpern gegen das Hauptglykosylphosphatidylinositol-verankerte Oberflächenbeschichtungsprotein EP Procyclin (10) in Fig., 4 G und H sind . Interessanterweise ist bekannt, dass Epicyclin die gesamte Zelle gleichmäßig bedeckt, aber das beobachtete Signal ist gruppiert. Wir führen dies auf die Tendenz der darunter liegenden Lipidflöße zurück, sich unter dem Einfluss von Antikörpern anzusammeln, ein Prozess, den eine Fixierung in Formaldehyd nicht verhindern kann. Die Goldmarkierungen beleuchten auch die dreidimensionale Konformation der Zelle in einer Weise, die an das erinnert, was Standard-SEM darstellen kann (ein ausgezeichnetes, repräsentatives SEM-Bild von T. brucei finden Sie unter http://tryps.rockefeller.edu/crosslab_intro.html).

Offensichtlich hat TEM im Allgemeinen eine bessere Auflösung als wet SEM, aber die im Beispiel von T. brucei zum Vergleich dargestellten Bilder sind „typische“ Bilder, die im selben Labor erhalten wurden., Da wet SEM in seiner Nützlichkeit anders ist als TEM und optische Mikroskopie, in T. brucei kann es als eine wichtige komplementäre Fähigkeit gesehen werden, und man kann erwarten, dass das vollständige Bild durch eine Kombination von optischen gegeben werden würde, TEM, und Wet-SEM-Technik.

Gewebeschnitten. Wet SEM kann für dicke Proben wie Gewebefragmente verwendet werden, indem die Probe einfach gegen die Membran montiert wird. Die begrenzte Abtasttiefe von BSEs ermöglicht die Abbildung eines „virtuellen Abschnitts“, der sich von der Oberfläche in eine definierte Tiefe von bis zu einigen Mikrometern erstreckt, ohne dass ein dünner Schnitt erforderlich ist.,

Abb. 5 A und B zeigt die direkte Visualisierung von unbehandeltem Gewebe von Maus. Abb. 5A ist ein Bild mit kleiner Vergrößerung des Herzgewebes. Die Organisation der Muskelzellen ist offensichtlich. Zoomen auf eine Zelle (Abb. 5B) gibt einen lebendigen Blick auf den Kern und die intrazellulären Organellen, möglicherweise Mitochondrien, und ihre Dispersion in der Zelle. Wie oben für kultivierte Zellen gezeigt, ist die Färbung von Geweben vorteilhaft, aber nicht zwingend erforderlich und kann die Visualisierung vieler Merkmale verbessern. Abb. 5 C und D zeigt eine Region der Nierenrinde einer Ratte., Die Färbung (Kaliumferricyanid) akzentuiert die Gesamtorganisation und Zellkontakte innerhalb der Epithelie der Nierentubuli. Eine sorgfältige Anpassung der Färbungs-und Bildgebungsbedingungen kann unterschiedliche und komplementäre Informationen wie die Gewebearchitektur aufdecken; z. B. mit Uranylacetat gefärbte Gewebe ergeben ein klares Bild der extrazellulären Matrix (Daten nicht gezeigt).

Gleichzeitige Photonensammlung (CL). Die BSE-Detektion im nassen SEM kann durch die gleichzeitige Sammlung von Photonen ergänzt werden., Der Rasterelektronenstrahl regt Moleküle in der Probe an, die dann bei charakteristischen Wellenlängen (CL) Licht emittieren können. Die Lichtintensität wird dann verwendet, um ein Bild der Verteilung von Szintillationsmolekülen abzuleiten, die entweder für die Zelle endogen sind oder fremd eingeführt werden können. Dieses Bild wird gleichzeitig mit der Bildgebung durch BSE mit einer Auflösung erhalten, die durch Elektronen–Materie-Wechselwirkungen und nicht durch Lichtbeugung begrenzt ist (6). Wir haben einen Lichtleiter in die Flüssigkeit unter der Probe eingeführt, der das emittierte Licht zu einem Fotomultiplier führt., Dieser Aufbau erreicht eine gute Kopplung und effiziente Sammlung der vom Elektronenstrahl angeregten Photonen, ohne die Effizienz der gleichzeitigen BSE-Detektion zu beeinträchtigen.

Abb. 6 zeigt unbehandelte CHO-Zellen, die gleichzeitig durch BSE und Photonen visualisiert werden. In Abb. 6A, die Zellgrenzen sind im Elektronenbildmodus klar umrissen, und der Kern (zusammen mit seinen Nukleolen) ist prominent, ebenso wie die dunklen ≈1-µm-Flecken um den Kern herum. Diese erscheinen im Zytoplasma aller von uns untersuchten eukaryotischen Zellen, und obwohl ihre Anzahl variiert, sind sie normalerweise um den Kern verteilt., Im CL-Bild in Abb. 6B sind Zellumriss und Zellkern klar definiert, was auf eine Verteilung von Szintillationsmolekülen (ähnlich der Autofluoreszenz) in der Zelle hindeutet. In diesem Modus zeichnen sich dieselben Flecken durch eine hohe Photonenemission aus. Die Kombination aus einem hohen Kathodolumineszenzsignal und hohem Kohlenstoffgehalt ist typisch für Lipidtröpfchen (11), die am Energiespeicher der Zelle (12) beteiligt sind., Ein unabhängiger Test der Zugabe von 200 µM Ölsäure verursachte eine starke Proliferation dieser Tröpfchen in der Zelle (Daten nicht gezeigt), im Einklang mit der Vorstellung, dass die beobachteten Flecken Lipidtröpfchen sind.

Wet SEM hat einen Vorteil gegenüber Standard-SEM-Techniken bei der Erhaltung von Lipiden, insbesondere bei großen Aggregaten wie Lipidtröpfchen. Die Notwendigkeit des Trocknens erspart den Lipiden organische Lösungsmittel, die sie auflösen können. Obwohl die Osmiumbehandlung einige Lipiddoppelschichten beibehält, reagiert das Osmium in größeren Aggregaten schnell auf eine äußere Kruste, die Osmium nicht einlässt, wodurch die Aggregate anfällig für eine nachfolgende Behandlung mit organischen Lösungsmitteln werden., Bei kryogenen Präparaten ist auch die Tendenz des Spaltprozesses, entlang der Lipid–Wasser-Grenzen zu reißen, eine Gefahr für große Lipidstrukturen.

Die hochauflösende Bildgebung von Markern ist eine höchst wünschenswerte Fähigkeit des CL-Detektionsmodus, die die Entwicklung von Etiketten für bestimmte Moleküle in Zellen erfordert. In Abb. 9, das als unterstützende Information auf der PNAS-Website veröffentlicht wird, zeigen wir, dass Standardleuchtstoffperlen mit einem Durchmesser von 0,2 µm Photonen intensiv unter dem Elektronenstrahl emittieren und mit einer Auflösung von ≈100 nm abgebildet werden können (7)., Die Bildgebung kleinerer Perlen ist durch eine geringe Helligkeit begrenzt, was zur Entwicklung spezieller Szintillationsperlen mit kleinem Durchmesser führt . Da der Mechanismus zur Anregung der Szintillation am stärksten ist, wenn der Strahl direkt auf die Perle auftrifft, erwarten wir, dass dies die Auflösung der Fluoreszenzbildgebung um eine Größenordnung über die mit der optischen Mikroskopie verfügbare Hinaus verlängern kann.