Good Mood

Introducere

Next-generation sequencing (NGS) s-a extins rapid în stabilirea clinice în haemato-oncologie și oncologie, deoarece poate aduce mari beneficii pentru diagnostic, selecție de tratament, și/sau prevestire pentru mulți pacienți (1)., Recent, au fost publicate mai multe articole despre validarea NGS-urilor profunde vizate în oncologia clinică (2, 3), inclusiv o recomandare cuprinzătoare a Asociației pentru Patologie Moleculară și a Colegiului patologilor americani (1). Cu toate acestea, lipsa standardizării metodelor NGS vizate limitează în continuare punerea lor în aplicare în practica clinică (4).

o provocare, în special, este detectarea corectă a mutațiilor prezente la frecvențele alelei cu variante joase (VAF) și standardizarea adâncimii de acoperire a secvențierii (1, 5, 6)., Acest lucru este deosebit de important pentru mutații care au clinice a efectelor în subclonal frecvențe (1), cum ar fi cazul TP53 mutații genetice (TP53mut) in leucemia limfocitară cronică (LLC) (7, 8). Aberațiile TP53 (TP53mut și / sau ștergerea cromozomului 17P) sunt printre cei mai puternici markeri prognostici și predictivi care ghidează deciziile de tratament în LLC (9)., În zilele noastre, Cercetare European de Inițiativă privind Leucemia Limfocitară Cronică (ERIC) recomandă detectarea TP53mut cu o limită de detecție (LOD) de cel puțin 10% VAF (10), și un corp tot mai mare de dovezi există dedicat impactului clinic de mici TP53 mutant subclone în LLC (7, 8).secvențierea Sanger și NGS direcționate profund sunt în prezent tehnicile cele mai utilizate pentru analiza TP53mut (10), precum și pentru analiza altor gene cu impact clinic la frecvențe joase ale alelelor., Deși secvențierea Sanger oferă o abordare de secvențiere relativ accesibilă, îi lipsește sensibilitatea necesară pentru detectarea subclonelor datorită limitei sale de detecție de 10-20% din alelele mutante (10). Analiza bazată pe NGS a câștigat astfel importanță în laboratoarele de diagnostic pentru detectarea variantelor somatice și sunt dezvoltate diverse evoluții tehnice ale strategiilor de corectare a erorilor, atât computaționale, cât și experimentale, pentru identificarea exactă a variațiilor genetice de nivel scăzut (11)., Prin urmare, abordăm importanța determinării corecte a adâncimii de secvențiere în diagnosticul NGS pentru a obține o detecție sigură și reproductibilă, nu numai a variantelor VAF scăzute. În cele din urmă, am realizat o diluție experiment pentru a confirma calculele teoretice, și suntem aproape de a discuta experiența noastră cu diagnostic de detectare a TP53mut la pacientii cu LLC și alte perspective despre NGS standardizare în diagnosticare a cancerului.,

NGS Secvențiere Adâncime și Rata de Eroare

NGS secvențiere adâncime afectează în mod direct reproductibilitatea varianta de detectare: cel mai mare număr de aliniat secvență citește, cea mai mare încredere la baza apel la o anumită poziție, indiferent de faptul dacă la bază este aceeași ca bază de referință sau este mutant (1). Cu alte cuvinte, erorile de secvențiere individuale sunt irelevante statistic atunci când sunt depășite de citirile corecte., Astfel, adâncimea de acoperire dorită trebuie determinată pe baza LOD intenționată, a toleranței pentru rezultate fals pozitive sau fals negative și a ratei de eroare de secvențiere (1, 11).folosind o distribuție binomială, se poate calcula probabilitatea de rezultate fals pozitive și fals negative pentru o rată de eroare dată, precum și LOD-ul intenționat, iar pragul pentru o variantă care solicită o anumită adâncime poate fi estimat (1)., De exemplu, având în vedere o rată de eroare de secvențiere de 1%, o sarcină de alelă mutantă de 10% și o adâncime de acoperire de 250 de citiri, probabilitatea de a detecta 9 sau mai puține citiri mutante este, conform distribuției binomiale, 0,01%. Prin urmare, probabilitatea de a detecta 10 sau mai multe citiri mutante este de 99,99% (100-0, 01%), iar pragul pentru o variantă de apelare poate fi definit. Cu alte cuvinte, o adâncime de acoperire de 250 cu un prag de cel puțin 10 citiri mutante va avea un 99.,99% probabilitatea ca 10% din sarcina alelei mutante să nu fie ratată de apelarea variantei (deși poate fi detectată într-o proporție diferită). În acest fel, riscul unui rezultat fals negativ este mult redus la minimum. Pe de altă parte, probabilitatea falselor pozitive depinde în mare măsură de rata de eroare de secvențiere (deoarece precizia tuturor măsurătorilor analitice depinde de raportul semnal-zgomot) (1, 11). În exemplul nostru, probabilitatea unui rezultat fals pozitiv este de 0,025%; cu toate acestea, rata de rezultate fals pozitive nu este de neglijat atunci când scăderea LOD la o valoare apropiată de rata de eroare., Ratele de eroare NGS intrinseci convenționale variază între 0,1 și 1% (scor de calitate Phred de 20-30) (1, 11) în funcție de platforma de secvențiere, de conținutul GC al regiunilor țintă (12) și de lungimea fragmentului, așa cum se arată în Illumina paired-end sequencing (13). Prin urmare, detectarea de variante la VAFs <2% este afectată de un risc ridicat de un rezultat fals pozitiv, indiferent de adâncimea de acoperire., De asemenea, este important să menționăm că succesiunea rata de eroare se aplică numai pentru erori produse prin secvențierea în sine și nu include alte erori introduse în ADN-ul de procesare și biblioteca de pregătire, în special în timpul amplificare pași, care crește în continuare ratele de eroare (1, 11).în prezent, nu există un consens cu privire la acoperirea minimă necesară într-un cadru clinic, utilizând o resecvenție orientată în profunzime de către NGS, astfel încât fiecare laborator trebuie să-și stabilească parametrii proprii pentru a satisface o calitate suficientă (1, 5)., Până în prezent, doar câteva studii au recomandat minim de criterii de acoperire pentru deep vizate NGS în oncologie clinică: 500 adâncimea de acoperire și un LOD de 5% (2), 300-500 adâncimea de acoperire, fără a-l sfida LOD (3), 250 de profunzime și un LOD de 5% cu prag de ajustare la 1.000 de adâncimea de acoperire este necesară în cazuri de eterogene variante în tumorală redusă celularitatea probe (1), și 100 de adâncime cu cel puțin 10 varianta citește și un LOD de 10% (10)., Conform distribuției datelor binominale, o adâncime de acoperire de 250 ar trebui să fie într-adevăr suficientă pentru a detecta VAF de 5% cu un prag de citire a variantei ≥5 (Figura 1). Pe de altă parte, analiza NGS cu o adâncime de acoperire de 100, împreună cu o cerință de cel puțin 10 variante de sprijin, conform recomandărilor consorțiului ERIC (10), ar avea ca rezultat un fals negativ de 45% pentru eșantioanele cu o LOD de 10%., Pentru a confirma aceste calcule teoretice, am efectuat două experimente de diluare independente pentru a estima performanța analizei TP53 NGS pentru a detecta 10% VAF la o adâncime de acoperire de 100 de citiri. Într-adevăr, am detectat 30% din falsele negative (5 probe pozitive din 7 probe true-pozitive și 9 probe pozitive din 13 probe true-pozitive) în două serii de secvențiere independente. Din păcate, rata fals negativă este adesea subestimată în resecvența vizată., De asemenea, un studiu recent a investigat inter-rezultatele de laborator somatice varianta de detectare cu VAFs între 15 și 50% în 111 laboratoare au raportat o Determinare de 5-15% (6) arată că marile erori în diagnostic NGS pot apărea de rezultate fals negative, chiar și în probele cu mare mutație sarcini (6). Dintre cele trei rezultate fals pozitive simultane, toate variantele au fost detectate corect, dar caracterizate greșit (6)., Deoarece laboratoarelor nu li s-a solicitat să raporteze adâncimea de acoperire pentru alte regiuni decât variantele identificate (6), putem presupune doar că acoperirea scăzută sau pragurile ridicate de apelare a variantelor au contribuit la rezultatele fals negative. Aceste rezultate evidențiază în continuare necesitatea unor parametri standardizați ai adâncimii de acoperire în NGS-urile de diagnosticare, luând în considerare erorile de secvențiere, precum și erorile specifice testului.

Frecvența de TP53 Subclonal Mutații în LLC Detectat Prin Diagnostic NGS

În scopul de a evalua apariție a scăzut VAF în lumea reală setări, am revizuit nostru cohorta de pacienți cu LLC examinat pentru TP53mut în nostru de diagnostic de laborator. TP53mut a fost evaluat așa cum s-a raportat anterior (14, 15). Pe scurt, TP53 (exoni 2-10 inclusiv 2 bp intronic se suprapun, 5′ și 3’UTR) a fost analizată folosind 100 ng gDNA pe reacție., Amplicon pe bază de biblioteci au fost ordonate ca asociat-end pe MiSeq (2×151, Illuminati) cu obiectiv minim citit adâncimi de 5.000 x. LOD de TP53mut a fost înființat la 1%, și variantele în intervalul 1-3% au fost confirmate de replicare. Consimțământul informat în scris a fost obținut de la toți pacienții care au fost înrolați în conformitate cu declarația de la Helsinki, iar studiul a fost aprobat de comitetul local de etică.

De diagnostic cohorta de 859 pacienții cu LLC (aprilie 2016–aprilie 2019), 25% (215/859) au fost pozitive pentru TP53mut, și de cei, de 52,6% (113/215) efectuate variante cu VAF la 10% sau mai mic., În conformitate cu observațiile noastre, un studiu recent (8) a raportat prezența a 63 și 84% povara redus (Sanger negativ) TP53muts la pacientii cu LLC la momentul diagnosticului și la momentul de tratament, respectiv, și a confirmat impactul negativ asupra supraviețuirii globale de TP53muts de mai sus 1% VAF la momentul de tratament (8).,

Calculator pentru Diagnosticare NGS Setări pentru Detectarea Subclonal Mutații

Pentru a ajuta laboratoare cu determinarea minimă de acoperire corespunzătoare parametrilor, oferim un mod simplu, user-friendly teoretice calculator (software), bazate pe distribuția binomială (Figura 2), descrise în Suplimentare de Fișiere. O aplicație web (sau desktop) și coduri sursă independente în R sunt accesibile pe Github: https://github.com/mvasinek/olgen-coverage-limit., Folosind acest calculator, parametrii corecți ai adâncimii de secvențiere și numărul minim corespunzător de variante citite pentru o rată de eroare de secvențiere dată și LOD intenționat pot fi ușor determinate. În plus, utilizatorii pot lua în considerare și alte erori prin simpla adăugare a erorilor specifice testului la rata de eroare de secvențiere și folosind această eroare generală ca intrare în calculator. De exemplu, în cazul analizei mutaționale TP53 am calculat cu eroarea generală de ~1.16%, astfel am stabilit cerințele minime de adâncime de acoperire la 2.000 cu prag de minim 40 de citiri pentru 3% VAF.,