rezultate
probe netratate. În special, observăm că, chiar și în probele necolorate, diferențele dintre picăturile de apă și ulei (Fig. 1 B și C ) sau între diferiți constituenți ai celulei (Fig. 1D) generează un contrast suficient pentru a le distinge. În celule, materialele cu Z mai mare, cum ar fi sărurile, fosforul și fierul, care pot fi concentrate în diferite regiuni, tind să îmbunătățească contrastul. Fig., 1D prezintă o celulă ovariană de hamster chinezesc netratată (CHO) în mediu normal de cultură la temperatura camerei. Conturul celulei și nucleul cu structura sa internă sunt clar vizibile, la fel ca o serie de particule sferice întunecate în citoplasmă. Identificarea acestor particule ca picături de lipide este discutată mai jos.
colorarea metalelor grele. Limitele rezoluției și contrastului atunci când se observă materiale low-Z sugerează că se pot obține avantaje substanțiale prin colorarea celulelor cu markeri High-Z, cum ar fi pete dense de electroni sau etichete de aur cu nanoparticule., Într-adevăr, putem detecta margele de aur în apă până la un diametru de 10 nm folosind membrane ultrathin (datele nu sunt prezentate).colorarea diferențială a organelelor din interiorul celulelor folosind materiale electrondense este un standard în tehnica EM, deși nu se aplică de obicei pentru SEM. Fig. 2 prezintă o varietate bogată de structuri din interiorul celulelor cultivate care au fost cultivate direct pe membrana despărțitoare și apoi fixate și colorate cu acetat de uranil (8). Organelele intracelulare sunt clar vizibile, inclusiv detaliile interne ale mitocondriilor (Fig. 2C ), fibre de stres actinic (Fig., 2D) și structuri tubulare și citoscheletice complexe (Fig. 2 A și B ). Energia fasciculului superior din Fig. 2C sonde structura internă, în timp ce la energie mai mică (Fig. 2D), suprafața apropiată de membrană este vizualizată. Astfel, diferite energii pot fi folosite pentru a obține informații tridimensionale.
imagistica celulelor colorate. Asteriscurile denotă nuclee, iar săgețile subțiri denotă mitocondriile. (A) celule HeLa crescute pe membrană în mediu normal de creștere, apoi fixate cu paraformaldehidă și colorate cu acetat de uranil (imagistică la 12 kV)., (B) mărirea dreptunghiului marcat prezentat în A. (C) celulă CHO fixată cu glutaraldehidă și paraformaldehidă, colorată cu acetat de uranil și menținută în apă (imaginată la 30 kV). Săgeata groasă denotă un mitocondrion care înconjoară o picătură de lipide. (Inserție) mărire mai mare care arată mitocondriile (săgeți subțiri). (D) Fibre de actină în celulele CHO colorate. Tratamentul și imagistica sunt descrise pentru A.
markeri de aur nanoparticule. Rezoluția ridicată și specificitatea detectării pot fi obținute prin legarea anticorpilor sau a altor liganzi., Ca și în cazul altor metode EM, etichetarea se face cel mai convenabil prin utilizarea nanoparticulelor de aur. Spre deosebire de transmission EM (TEM), care eșantionează doar secțiuni foarte subțiri și adesea arbitrare, wet SEM permite o comutare rapidă între viziunea locală și globală a etichetării pe toată celula. Fig. 3 A și B arată cum au fost utilizați anticorpi antiepidermici monoclonali antiepidermici marcați cu aur de 40 nm pentru etichetarea receptorilor factorului de creștere epidermal pe celulele canceroase A431 intacte., Fixarea este adesea utilă și convenabilă chiar și în SEM umed și poate facilita etichetarea, precum și transferul la microscop. Celulele prezentate aici sunt, de asemenea, colorate cu acetat de uranil, ceea ce permite alinierea receptorilor marcați cu structura generală a celulelor. Contrastul ridicat și dimensiunea uniformă a nanoparticulelor permit identificarea și localizarea fără echivoc. Cunoașterea localizării precise a moleculelor de receptor unic deschide posibilitatea măsurării evenimentelor, cum ar fi dimerizarea receptorilor induși de factorul de creștere epidermal., Colorarea celulelor nu este necesară pentru etichetare și am inclus o imagine a celulelor necolorate, etichetate (Fig. 7, care este publicat ca informații justificative pe site-ul web PNAS). De asemenea, este prezentată o imagine care demonstrează că marcarea părților interne ale celulei este posibilă (Fig. 8, care este publicat ca informații justificative pe site-ul web PNAS), în acest caz, marcarea mitocondriilor cu margele de aur. Etichetarea filamentelor de actină din interiorul celulelor a fost, de asemenea, realizată prin utilizarea particulelor de aur subnanometru, urmată de îmbunătățirea argintului (datele nu sunt prezentate).
imagistica markerilor de aur nanoparticule pe celule. Vârfurile de săgeată denotă nanoparticule de aur. (A) receptori ai factorului de creștere Epidermal imunomarcați cu nanoparticule de aur de 40 nm pe celulele A431 și contracarați cu acetat de uranil (imagine la 30 kV). (B) de Mărire a marcat dreptunghi arată în E. (C) Prezumtiv gastrina receptorii de pe H. pylori bacterie, după incubare cu complexat biotinylated gastrina pe streptavidin-filmate de 20 nm, particule de aur, urmată de glutaraldehidă și sedimentare pe poli(l-lizina) acoperite cu membrană (sonda la 20 kV).,
un exemplu de etichetare a aurului pe bacterii este dat în Fig. 3c . Aici, prezumtiv gastrina receptorilor de Helicobacter pylori (9) este detectat de incubare cu complexe de biotinylated gastrină și streptavidin-filmate de 20 nm nanoparticule de aur. Administrarea gastrinei biotinilate înainte de cea a aurului acoperit cu streptavidină nu a produs aproape nici o atașare a nanoparticulelor la bacterie. Acest rezultat a fost obținut independent de timpul dintre cele două etape, sugerând că absorbția gastrinei în H. pylori este aproape imediată., Faptul că gastrina complexată nu a intrat în celule indică posibilitatea definirii limitelor dimensiunii particulelor care pot fi internalizate de bacterii.
Compararea tehnicilor imagistice (Trypanosoma brucei). Este util să comparăm această tehnologie cu tehnicile imagistice existente utilizând un sistem cu un singur model. Un astfel de studiu este detaliat în Fig. 4, folosind forma prociclică a parazitului T. brucei care se propagă în mijlocul muștei tsetse. Primele trei imagini afișează modurile existente de imagistică: microscopia fluorescentă optică (Fig., 4A), microscopie de contrast cu interferențe diferențiale (Fig. 4B) și TEM (Fig. 4c). Puterea tehnicilor existente este evidentă: marcarea localizată în fluorescență și secțiuni detaliate în TEM. Optica netratată (Fig. 4B ) și wet-SEM (Fig. 4D) imaginile delimitează marginile celulei, dar au un contrast scăzut și nu au detalii. Ambele subliniază nucleul, dar alte organele care apar în imaginea de contrast a interferenței diferențiale nu sunt clar identificate, în timp ce imaginea wet-SEM scoate în evidență picăturile lipidice într-un avantaj. Colorarea tetroxidului de osmiu (Fig., 4E) nu este la fel de util în acest sistem, subliniind mai ales picăturile lipidice și unele organite interioare neidentificate. Cea mai puternică imagine este văzută în Fig. 4F, pentru care a fost utilizată colorarea cu acetat de uranil. Avantajul imagisticii intacte cu care poate fi văzută întreaga celulă (împreună cu structurile sale interne fine care pot fi observate în detaliu) este evident, în special în comparație cu imagistica TEM (Fig. 4c). În cele din urmă, umed-imagistica SEM de celulă întreagă specifice marcarea cu anticorpi împotriva majore glycosylphosphatidylinositol-ancorat strat de suprafață de proteine EP procyclin (10) este prezentată în Fig., 4 G și H . Interesant este că prociclina EP este cunoscută pentru a acoperi întreaga celulă uniform, dar semnalul observat este grupat. Atribuim acest lucru tendinței plutelor lipidice subiacente de a se grupa sub influența anticorpilor, un proces pe care fixarea în formaldehidă nu îl poate preveni. Markerii de aur elucidează, de asemenea, conformația tridimensională a celulei într-o manieră care amintește de imaginea SEM standard (o imagine sem excelentă și reprezentativă a lui T. brucei poate fi găsită la http://tryps.rockefeller.edu/crosslab_intro.html).
imagistica multimodală a lui T. brucei., Lungimea tipică a unei celule este de 20 µm lungime și 3 µm lățime. (A) microscopie de fluorescență confocală. S-au utilizat anticorpi anti-EP prociclină (Cedarline), iar legarea a fost detectată cu anti-șoarece legat de izotiocianat de fluoresceină (verde). Colorarea nucleului și a kinetoplastului a fost cu iodură de propidiu (roșu). (B) imagistică optică (contrast de interferență diferențială). (C) secțiuni TEM ale unei celule, urmate de colorarea cu acetat de uranil, care dezvăluie organele interne. (D) Imagistica Wet-SEM a celulelor întregi, hidratate, necolorate. (E) așa cum este descris pentru D folosind colorarea cu tetroxid de osmiu., (F) așa cum este descris pentru D folosind colorarea cu acetat de uranil. (G) markeri de aur de nanoparticule legați de anticorpi anti-șoarece, care arată locația proteinei prociclinei EP de suprafață și care permit, în același timp, o vedere tridimensională. (H) mărire mai mare a secțiunii medii a celulei prezentată în G, elucidând o zonă de helicitate tridimensională în celulă.evident, TEM va avea o rezoluție mai bună, în general, decât sem umed, dar imaginile prezentate în exemplul lui T. brucei pentru comparație sunt imagini „tipice” obținute în același laborator., Deoarece wet SEM este diferit în utilitatea sa decât TEM și microscopia optică, în T. brucei poate fi văzută ca o capacitate complementară importantă și se poate aștepta ca imaginea completă să fie dată de o combinație de tehnică optică, TEM și wet-sem.
secțiuni de țesut. Sem umed poate fi utilizat pentru specimene groase, cum ar fi fragmente de țesut, prin simpla montare a specimenului pe membrană. Adâncimea limitată de eșantionare a BSEs permite imagistica unei „secțiuni virtuale”, care se extinde de la suprafață într-o adâncime definită de până la câțiva micrometri, fără a fi nevoie de o secționare subțire.,
Fig. 5 A și B arată vizualizarea directă a țesuturilor netratate de la șoarece. Fig. 5A este o imagine cu mărire mică a țesutului cardiac. Organizarea celulelor musculare este evidentă. Mărirea pe o celulă (Fig. 5B) oferă o imagine vie a nucleului și a organelor intracelulare, eventual a mitocondriilor și a dispersiei lor în celulă. După cum sa arătat mai sus pentru celulele cultivate, colorarea țesuturilor este avantajoasă, dar nu imperativă și poate îmbunătăți vizualizarea multor caracteristici. Fig. 5 C și D prezintă o regiune a cortexului renal al unui șobolan., Colorarea (fericianura de potasiu) accentuează organizarea generală și contactele celulare din epiteliul tubulilor renali. Ajustarea atentă a condițiilor de colorare și imagistică poate dezvălui informații diferite și complementare, cum ar fi arhitectura țesuturilor; de exemplu, țesuturile colorate cu acetat de uranil oferă o imagine clară a matricei extracelulare (datele nu sunt prezentate).
imagistica țesuturilor. (A) inimă de șoarece, netratată, imaginată direct în suportul de probă la 30 kV. (B) mărire mai mare a dreptunghiului prezentat la punctul A., (C) rinichiul de șobolan a fost disecat, tăiat și fixat în formalină timp de 24 de ore. țesutul a fost apoi colorat cu 0,1% acetat de uranil timp de 10 min. C și D prezintă celule epiteliale în interiorul suprafeței interioare a tubulilor razelor medulare. Grila care susține membrana este vizibilă în această imagine. (D) mărirea casetei indicate în C.
colecție simultană de fotoni (CL). Detectarea ESB în SEM umed poate fi completată de colectarea simultană de fotoni., Fasciculul de electroni de baleiaj excită moleculele din probă, care apoi pot emite lumină la lungimi de undă caracteristice (CL). Intensitatea luminii este apoi utilizată pentru a obține o imagine a distribuției moleculelor scintilante, fie endogene la celulă, fie etichete care pot fi introduse extern. Această imagine este obținută simultan cu imagistica prin ESB la o rezoluție limitată de interacțiunile electron-materie și nu de difracția luminii (6). Am introdus un ghid de lumină în lichidul de sub eșantion, care ghidează lumina emisă către un fotomultiplicator., Această configurație realizează o bună cuplare și o colectare eficientă a fotonilor excitați de fasciculul de electroni fără a compromite eficiența detectării simultane a ESB.
Fig. 6 prezintă celule CHO netratate, vizualizate simultan de ESB și fotoni. În Fig. 6A, marginile celulare sunt clar conturate în modul de imagistică electronică, iar nucleul (împreună cu nucleolii săi) sunt proeminenți, la fel ca și petele întunecate ≈1-µm din jurul nucleului. Acestea apar în citoplasma tuturor celulelor eucariote pe care le-am investigat și, deși numărul lor variază, ele sunt de obicei dispersate în jurul nucleului., În imaginea CL prezentată în Fig. 6B, conturul celulei și nucleul sunt clar definite, indicând o distribuție a moleculelor scintilante (similare cu autofluorescența) în celulă. În acest mod, aceleași pete se caracterizează printr-o emisie ridicată de fotoni. Combinația dintre un semnal catodoluminescent ridicat și un conținut ridicat de carbon este tipică picăturilor lipidice (11), care participă la stocarea energiei celulei (12)., Un test independent de adăugare a acidului oleic de 200 µM a determinat o proliferare puternică a acestor picături în celulă (datele nu sunt prezentate), în concordanță cu ideea că petele observate sunt picături lipidice.
imagistica simultană cu fotoni retrocedați și excitați cu fascicul de electroni (CL). (A) celulă CHO necolorată, imaginată prin utilizarea BSEs conform descrierii din Fig. 1D . (B) imagine luminoasă emisă realizată simultan cu cea prezentată la punctul A.,
Wet SEM are un avantaj față de tehnicile standard SEM în conservarea lipidelor, în special în agregate mari, cum ar fi picăturile de lipide. Eliminarea nevoii de uscare salvează lipidele de solvenții organici care le pot dizolva. Deși tratamentul cu osmiu va păstra unele bistraturi lipidice, în agregatele mai mari, osmiul reacționează rapid pentru a crea o crustă externă care nu lasă osmiul să intre, lăsând agregatele vulnerabile la tratamentul organic-solvent ulterior., În preparatele criogenice, tendința procesului de scindare de a se sparge de–a lungul limitelor lipidelor-apă este, de asemenea, un pericol pentru structurile lipidice mari.imagistica de înaltă rezoluție a markerilor este o capacitate foarte dorită a modului de detectare a CL, necesitând dezvoltarea de etichete pentru molecule specifice din celule. În Fig. 9, care este publicat ca informații justificative pe site-ul web PNAS, demonstrăm că margelele fluorescente standard cu diametrul de 0,2 µm emit fotoni intens sub fasciculul de electroni și pot fi imaginate cu o rezoluție de ≈100 nm (7)., Imagistica margelelor mai mici este limitată de luminozitatea scăzută, ceea ce implică dezvoltarea de margele de scintilație specializate la diametru mic . Deoarece mecanismul de excitație a scintilației este cel mai puternic atunci când fasciculul afectează direct talonul, ne așteptăm ca acest lucru să extindă rezoluția imaginii fluorescente cu un ordin de mărime dincolo de cel disponibil cu microscopie optică.
