Good Mood

introduktion

nästa generations sekvensering (NGS) har snabbt expanderat till den kliniska inställningen inom hemato-onkologi och onkologi, eftersom det kan ge stora fördelar för diagnos, val av behandling och / eller prognostisering för många patienter (1)., Nyligen publicerades flera artiklar om validering av djupa riktade NGS i klinisk onkologi (2, 3), inklusive en omfattande rekommendation från Association for Molecular Pathology och College of American Pathologists (1). Bristen på standardisering av riktade NGS-metoder begränsar emellertid fortfarande deras genomförande i klinisk praxis (4).

en utmaning i synnerhet är korrekt detektering av mutationer som förekommer vid låg variantyllelfrekvenser (VAF) och standardisering av sekvenstäckningsdjup (1, 5, 6)., Detta är särskilt viktigt för mutationer som har kliniska effekter vid subklonala frekvenser (1) såsom fallet med TP53 genmutationer (TP53mut) i kronisk lymfocytisk leukemi (CLL) (7, 8). TP53 avvikelser (tp53mut och / eller kromosom 17p radering) är bland de starkaste prognostiska och prediktiva markörer vägledande behandlingsbeslut i CLL (9)., Idag, den Europeiska Initiativ för Forskning om Kronisk Lymfatisk Leukemi (ERIC) rekommenderar att upptäcka TP53mut med en detektionsgräns (LOD) på minst 10% VAF (10), och en växande mängd bevis som existerar dedikerade till att den kliniska effekten av små TP53 muterade subclones i CLL (7, 8).

Sanger-sekvensering och djupt riktade NGS är för närvarande de tekniker som används mest för tp53mut-analys (10) samt för analys av andra gener med kliniska effekter vid låga allelfrekvenser., Även om Sanger-sekvensering ger en relativt tillgänglig sekvenseringsmetod saknar den känslighet som behövs för att detektera subkloner på grund av dess detektionsgräns på 10-20% av muterade alleler (10). NGS – baserad analys har därmed blivit framträdande i diagnostiska laboratorier för detektering av somatiska varianter och olika tekniska utvecklingar av felkorrigeringsstrategier, både beräknings-och experimentella, utvecklas för korrekt identifiering av lågnivågenetiska variationer (11)., Vi tar därför upp vikten av korrekt bestämning av sekvenseringsdjup i diagnostiska NGS för att få en säker och reproducerbar detektering, inte bara av låga VAF-varianter. Slutligen utförde vi ett utspädningsexperiment för att bekräfta våra teoretiska beräkningar, och vi avslutar genom att diskutera vår erfarenhet av diagnostisk upptäckt av TP53mut hos CLL-patienter och ytterligare perspektiv på NGS-standardisering inom cancerdiagnostik.,

ngs Sekvenseringsdjup och felfrekvens

ngs sekvenseringsdjup påverkar direkt reproducerbarheten för variantdetektering: ju högre antalet justerade sekvenser läser, desto högre förtroende för bassamtalet vid en viss position, oavsett om bassamtalet är detsamma som referensbasen eller muteras (1). Med andra ord, individuella sekvenseringsfel läser är statistiskt irrelevanta när de är underlägsna av korrekta läsningar., Således bör det önskade täckningsdjupet bestämmas baserat på den avsedda LOD, toleransen för falska positiva eller falska negativa resultat och felfrekvensen för sekvensering (1, 11).

med hjälp av en binomialfördelning kan sannolikheten för falskt positiva och falska negativa resultat för en viss felfrekvens samt den avsedda LOD beräknas, och tröskeln för en variant som kräver ett visst djup kan uppskattas (1)., Till exempel, med tanke på en sekvenseringsfelhastighet på 1%, en mutant allelbelastning på 10% och ett djup av täckning 250 läser, är sannolikheten att detektera 9 eller färre muterade läsningar, enligt binomialfördelningen, 0,01%. Därför är sannolikheten att detektera 10 eller fler muterade läsningar 99,99% (100-0.01%), och tröskeln för en variantanrop kan definieras. Med andra ord kommer ett täckningsdjup på 250 med en tröskel på minst 10 muterade läsningar att ha en 99.,99% sannolikhet att 10% av den muterade allelbelastningen inte kommer att missas av variantanropet (även om det kan detekteras i en annan andel). På detta sätt minimeras risken för ett falskt negativt resultat kraftigt. Å andra sidan beror sannolikheten för falska positiva starkt på sekvenseringsfelfrekvensen (eftersom noggrannheten hos alla analytiska mätningar beror på signal-brusförhållandet) (1, 11). I vårt exempel är sannolikheten för ett falskt positivt resultat 0,025%; emellertid är andelen falska positiva inte försumbar när LOD minskar till värdet nära felfrekvensen., Konventionella inbyggda ngs-felfrekvenser varierar mellan 0,1 och 1% (Phred-kvalitetsresultat på 20-30) (1, 11) beroende på sekvenseringsplattformen, GC-innehållet i målregionerna (12) och fragmentlängden, som visas i Illumina Parade-end-sekvensering (13). Därför påverkas detekteringen av varianter vid VAFs<2% av en hög risk för ett falskt positivt resultat, oavsett täckningsdjupet., Det är också viktigt att nämna att sekvenseringsfelprocenten endast gäller för fel som produceras genom sekvensering och inte innehåller andra fel som införs under DNA-bearbetning och biblioteksförberedelse, särskilt under förstärkningssteg, vilket ytterligare ökar felfrekvensen (1, 11).

minsta Sekvenstäckning i kliniska miljöer

det finns för närvarande ingen konsensus om den Minsta erforderliga täckningen i en klinisk miljö med hjälp av djup riktad resequencing av NGS, och så varje laboratorium måste ställa in sina egna parametrar för att uppfylla tillräcklig kvalitet (1, 5)., Hittills har endast ett fåtal studier rekommenderat minimitäckningskriterierna för djupt riktade NGS i klinisk onkologi: 500 täckningsdjup och en LOD på 5% (2), 300-500 täckningsdjup utan att trotsa LOD (3), 250 djup och en LOD på 5% med tröskeljustering till 1000 täckningsdjup krävs vid heterogena varianter i låga tumörcellularitetsprover (1) och 100 djup med minst 10 variantläsningar och en LOD på 10% (10)., Enligt binominaldatadistributionen bör ett täckningsdjup på 250 verkligen vara tillräckligt för att detektera 5% VAF med ett tröskelvärde för variantstödjande värden ≥5 (Figur 1). Å andra sidan skulle ngs-analys med ett täckningsdjup på 100 tillsammans med ett krav på minst 10 variantstödjande läsningar som rekommenderas av ERIC-konsortiet (10) leda till ett falskt negativt resultat på 45% för prover med ett LOD på 10%., För att bekräfta dessa teoretiska beräkningar utförde vi två oberoende utspädningsexperiment för att uppskatta prestanda för TP53 ngs-analys för att detektera 10% VAF på ett djup av täckning av 100-läsningar. Faktum är att vi upptäckte 30% av falska negativ (5 positiva prover av 7 sanna positiva prover och 9 positiva prover av 13 sanna positiva prover) i två oberoende sekvenseringskörningar. Tyvärr underskattas den falska negativa hastigheten ofta i riktad resequencing., En nyligen genomförd studie som undersöker interlaboratorieresultat av somatisk variantdetektering med VAFs mellan 15 och 50% i 111 laboratorier med rapporterade lod på 5-15% (6) visar också att stora fel i diagnostiska NGS kan uppstå från falska negativa resultat, även i prover med höga mutationsbelastningar (6). Av tre samtidiga falska positiva resultat upptäcktes alla varianter korrekt men felaktigt karaktäriserade (6)., Eftersom laboratorier inte har blivit ombedda att rapportera täckningsdjup för andra regioner än de identifierade varianterna (6), kan vi bara anta att låga täcknings-eller högvariantgränser bidrog till de falska negativa resultaten. Dessa resultat belyser ytterligare behovet av standardiserade täckningsdjupsparametrar i diagnostiska NGS, med hänsyn till sekvenseringsfel samt analysspecifika fel.

frekvens av TP53 Subklonala mutationer i CLL detekteras genom diagnostiska NGS

för att utvärdera förekomsten av låg VAF i verkliga inställningar, vi granskade vår kohort av CLL patienter undersöktes för TP53mut i vårt diagnostiska laboratorium. TP53mut utvärderades som rapporterats tidigare (14, 15). Kortfattat, TP53 (exoner 2-10 inklusive 2 bp intronic överlappning, 5′ och 3’UTR) analyserades med 100 ng gDNA per reaktion., Amplicon – baserade bibliotek sekvenserades som parat-end på MiSeq (2×151, Illumina) med minsta målläsningsdjup på 5,000 x. LOD av TP53mut sattes upp till 1%, och varianterna i intervallet 1-3% bekräftades genom replikering. Skriftligt informerat samtycke erhölls från alla patienter som registrerades i enlighet med Helsingforsdeklarationen, och studien godkändes av den lokala etiska kommittén.

av den diagnostiska kohorten av 859 CLL-patienter (April 2016-April 2019) var 25% (215/859) positiva för TP53mut, och av dessa var 52,6% (113/215) utförda varianter med VAF vid 10% eller lägre., I linje med våra observationer, en ny studie (8) rapporterade förekomsten av 63 och 84% låg belastning (Sanger negativ) TP53muts hos CLL patienter vid tidpunkten för diagnos och vid tidpunkten för behandlingen, respektive, och bekräftade den negativa inverkan på den totala överlevnaden av TP53muts över 1% VAF vid tidpunkten för behandlingen (8).,

kalkylator för diagnostiska ngs-inställningar för detektering av Subklonala mutationer

för att hjälpa laboratorier med bestämning av minsta korrekta täckningsparametrar tillhandahåller vi en enkel, användarvänlig teoretisk kalkylator (programvara) baserad på binomialfördelningen (Figur 2), som beskrivs i tilläggsfilen. En webb (eller stationär) applikation och fristående källkoder i R är tillgängliga på Github: https://github.com/mvasinek/olgen-coverage-limit., Med hjälp av denna räknare kan de korrekta parametrarna för sekvenseringsdjup och motsvarande minsta antal variant läses för en given sekvenseringsfelhastighet och avsedd LOD enkelt bestämmas. Dessutom kan användarna också ta hänsyn till andra fel genom att helt enkelt lägga till analysspecifika fel i sekvenseringsfelfrekvensen och använda detta övergripande fel som en inmatning till räknaren. Till exempel, i vårt fall av TP53-mutationsanalys beräknade vi med det övergripande felet på ~1.16%, så vi ställer in våra minsta täckningsdjup krav på 2,000 med tröskeln på minst 40 läser för 3% VAF.,

diskussion

även om diagnostiska NGS har fått framträdande i kliniska inställningar för bedömning av somatiska mutationer i cancer, begränsar otillräcklig standardisering av sekvenseringsparametrar fortfarande genomförandet i klinisk praxis (1), främst för varianter som finns vid låga allelfrekvenser (4). Vi tog därför upp den tekniska frågan om korrekt bestämning av sekvenseringsdjupet i diagnostiska NGS för att få säkra och reproducerbara upptäckter av låga VAF-varianter., I synnerhet utförde vi teoretiska beräkningar för att bestämma det optimala täckningsdjupet för den önskade sannolikheten för detektering av varianter vid låga allelfrekvenser, med hänsyn till sekvenseringsfelfrekvensen. Dessutom bekräftade vi dessa teoretiska beräkningar genom att genomföra utspädningsexperiment. Baserat på dessa observationer rekommenderar vi ett djup av täckning på 1,650 eller högre (tillsammans med respektive tröskel på minst 30 muterade läsningar) för att ringa ≥3% varianter för att uppnå en 99,9% Sannolikhet för variantdetektering, med endast det konventionella ngs-sekvenseringsfelet., Varianter i intervallet 1-3% VAF kan endast anropas om den erhållna sekvensdata är av hög kvalitet (genomsnittligt Q30 > 90%) och/eller när varianterna bekräftas genom replikering eller ortogonalmetoden (1, 11, 16). Vi tillhandahåller också en enkel, användarvänlig teoretisk kalkylator (programvara) för att hjälpa laboratorier med att lösa rätt sekvenseringsdjup och motsvarande minsta antal variant läser samtidigt som man tar hänsyn till sekvenseringsfelfrekvensen. Vår enkla kalkylator kan bidra till att minimera de falska positiva och falska negativa resultaten i diagnostiska NGS.,

ändå påverkas korrekt sekvenseringsdjup också av analysspecifika faktorer (1). Fel kan uppstå i många steg under DNA-bearbetning och biblioteksberedning. De vanligaste är förstärkningsfel som infördes under ngs-bibliotekets förberedelse (1, 12, 17). Andra vanliga felkällor har att göra med bibliotekets komplexitet (antalet oberoende DNA-molekyler analyseras), DNA-kvalitet och målregionens komplexitet etc. Alla potentiella analysspecifika fel bör åtgärdas genom testdesign, metodvalidering och kvalitetskontroll.,

för närvarande utvecklas nya felkorrigeringsstrategier, både beräknings-och experimentella, för att mildra de höga felfrekvenserna i diagnostiska NGS (11). Hittills är bland de mest lovande felkorrigeringsmetoderna UMI (unika molekylära identifierare), som korrigerar för PCR-fel (18) och signal-till-bruskorrigeringsmetoder (11). Dessa framsteg försöker minska LOD, vilket ökar sekvenseringsnoggrannheten som behövs för framtida möjligheter vid ngs-diagnos.,

för att förbättra standardiseringen i diagnostiska NGS är uppskattningen av korrekt täckningsdjup en rekommenderad utgångspunkt vid bedömning av tröskelvärden kring en viss NGS-analys. Det finns dock fortfarande brist på publicerad vägledning om de minsta tekniska kraven och dess rapportering i NGS, särskilt viktigt vid upptäckt av klonala och subklonala mutationer vid cancerdiagnostik., Detta beror främst på det breda utbudet av biblioteksberedningsmetoder, och många variabler som spelar en roll i varje specifik NGS-analys, som är svåra att standardisera, tillsammans med interlaboratorievariabilitet. Därför är det mycket önskvärt att fastställa minimikrav för tekniska krav och rapportera dem i de nationella generaldirektoraten., Baserat på vår erfarenhet av diagnostisk NGS i hemato-onkologi föreslår vi att rapportera minst följande tekniska parametrar: LOD, övergripande fel i ngs-analysen( eller åtminstone sekvenseringsfel), mängden DNA-ingång, källa och kvalitet på DNA, minsta täckningsdjup och andelen riktade baser som sekvenseras på detta minsta djup, totalt antal mål läser som täcker variantregion och antal läser som stöder varianten. Särskild vikt bör läggas vid ngs-standardisering av de formalinfasta paraffinbädda (FFPE) proverna (19, 20).,

tillsammans belyser vår studie vikten av korrekt sekvenseringsdjup och det minsta antalet läsningar som krävs för tillförlitlig och reproducerbar detektering av varianter med låg VAF i diagnostiska NGS. Beräkningen av korrekt sekvenseringsdjup för en viss felfrekvens med hjälp av vår användarvänliga teoretiska kalkylator (programvara) kan bidra till att minimera de falska positiva och falska negativa resultaten i diagnostiska NGS, i situationer relaterade till subklonala mutationer bland annat., De rigorösa testerna och standardiserade minimikraven för diagnostiska NGS är särskilt önskvärda för att säkerställa korrekta resultat i kliniska inställningar.

datatillgänglighet

datauppsättningarna som genereras för denna studie är tillgängliga på rimlig begäran till motsvarande författare.

Författarbidrag

AP och EK utformade studien, tolkade resultaten och skrev manuskriptet. AP, LS, TD och PS utförde ngs-analys. TP samlade in patientprover och kliniska data. MV utförde bioinformatikanalys och skrev kalkylatorkoden. TN beredd webbapplikation., Alla författare läste och godkände den slutliga versionen av manuskriptet.

Finansieringen

Bevilja stöd: MZ CR VES16-32339A, i en del av MH-CZ—DRO (FNOl, 00098892).

intressekonflikt uttalande

författarna förklarar att forskningen genomfördes i avsaknad av kommersiella eller finansiella relationer som kan tolkas som en potentiell intressekonflikt.

bekräftelser

Vi ber om ursäkt till de många författare vars artiklar inte kunde Citeras på grund av referensgränser.,

Supplementary Material