resultat
obehandlade prover. Framför allt observerar vi att även i ofärgade prover, skillnaderna mellan vatten och oljedroppar (Fig. 1 B och C ) eller mellan olika beståndsdelar i cellen (Fig. 1D) generera tillräcklig kontrast för att skilja dem. I celler tenderar högre Z-material som salter, fosfor och järn, som kan koncentreras i olika regioner, att förbättra kontrasten. Fig., 1D visar en obehandlad Kinesisk hamsterovariecell (CHO) i normalt odlingsmedium vid rumstemperatur. Cellens kontur och kärnan med dess inre struktur är tydligt synliga, liksom en serie mörka sfäriska partiklar i cytoplasman. Identifieringen av dessa partiklar som lipiddroppar diskuteras nedan.
färgning av tungmetall. Gränserna för upplösning och kontrast när man observerar lågz-material tyder på att betydande fördelar kan uppnås genom färgning av cellerna med Högz-markörer som elektrontäta fläckar eller nanopartikelguldetiketter., Faktum är att vi kan upptäcka guldpärlor i vatten ner till en diameter av 10 nm genom att använda ultratunna membran (data som inte visas).
Differentialfärgning av organeller inuti celler med hjälp av elektrondense material är en standard i EM-teknik, men används vanligtvis inte för SEM. Fig. 2 visar ett rikt utbud av strukturer inuti odlade celler som odlades direkt på partitionsmembranet och fixerades sedan och färgades med uranylacetat (8). Intracellulära organeller är tydligt synliga, inklusive interna detaljer om mitokondrier (Fig. 2C), aktinstressfibrer (Fig., 2D), och komplexa tubulära och cytoskeletala strukturer (Fig. 2 A och B ). Den högre strålen energi i Fig. 2C sonder inre struktur, medan vid lägre energi (Fig. 2D), ytan nära membranet visualiseras. Således kan olika energier användas för att erhålla tredimensionell information.
avbildning av färgade celler. Asterisker betecknar kärnor, och tunna pilar betecknar mitokondrier. A) HeLa-celler som odlas på membranet i normaltillväxtmedium, fixeras sedan med paraformaldehyd och färgas med uranylacetat (avbildat vid 12 kV)., B) förstoring av den markerade rektangeln som visas i A. c) CHO-cell som är fixerad med glutaraldehyd och paraformaldehyd, målad med uranylacetat, och som hålls i vatten (avbildad vid 30 kV). Den tjocka pilen betecknar en mitokondrion som omger en lipiddroppe. (Infälld) högre förstoring visar mitokondrier (tunna pilar). D) Aktinfibrer i färgade CHO-celler. Behandling och avbildning är som beskrivet för A.
nanopartikel Guldmarkörer. Hög upplösning och specificitet för detektering kan uppnås genom bindning av antikroppar eller andra ligander., Som med andra EM-metoder görs märkning mest bekvämt genom att använda guld nanopartiklar. I motsats till transmission EM (TEM), vilka prover endast mycket tunna och ofta godtyckliga sektioner, våt SEM möjliggör en snabb växling mellan den lokala och globala syn på märkning över hela cellen. Fig. 3 A och B visar hur 40-nm nanopartikel guldmärkta monoklonala antiepidermala tillväxtfaktorreceptorantikroppar användes för märkning av epidermala tillväxtfaktorreceptorer på intakta a431 cancerceller., Fixering är ofta användbar och bekväm även i våt SEM och kan underlätta märkning samt överföring till mikroskopet. De celler som presenteras här är också färgade med uranylacetat, vilket möjliggör anpassning av de märkta receptorerna med cellens allmänna struktur. Nanopartiklarnas höga kontrast och enhetliga storlek möjliggör entydig identifiering och lokalisering. Att känna till den exakta lokaliseringen av enskilda receptormolekyler öppnar möjligheten att mäta händelser som epidermal tillväxtfaktorinducerad receptordimerisering., Färgning av cellerna behövs inte för märkning, och vi har inkluderat en bild av ofärgade, märkta celler (Fig. 7, som offentliggörs som stödjande information på PNAS webbplats). Också visas är en bild som visar att märkning av inre delar av cellen är möjlig (Fig. 8, som publiceras som stödjande information på PNAS webbplats), i detta fall märkning av mitokondrier med guldpärlor. Märkning av aktinfilament inuti celler har också uppnåtts genom att använda subnanometer guldpartiklar, följt av silverförbättring (data visas inte).
avbildning av nanopartikel guldmarkörer på celler. Pilspetsarna betecknar guld nanopartiklar. (A) epidermala tillväxtfaktorreceptorer immunomärkta med 40-nm guld nanopartiklar på a431-celler och motverkade med uranylacetat (avbildad vid 30 kV). B) förstoring av den markerade rektangeln som visas i E. C) förmodade gastrin-receptorer på H. pylori-bakterien, efter inkubation med komplexbildade biotinylerade gastrin på streptavidinbelagda 20-nm guldpartiklar, följt av glutaraldehyd och sedimentering på det poly-(L-lysin) – belagda membranet(avbildat vid 20 kV).,
ett exempel på guldmärkning på bakterier ges i Fig. 3C . Här detekteras den förmodade gastrin-receptorn av Helicobacter pylori (9) genom inkubation med komplex av biotinylerad gastrin och streptavidinbelagda 20-nm guld nanopartiklar. Administrering av det biotinylerade gastrin före det av det streptavidinbelagda guldet gav nästan ingen fastsättning av nanopartiklar till bakterien. Detta resultat erhölls oberoende av tiden mellan de två stegen, vilket tyder på att upptaget av gastrin i H. pylori är nästan omedelbart., Det faktum att komplex gastrin inte kom in i cellerna pekar på möjligheten att definiera gränserna för storleken på partiklar som kan internaliseras av bakterierna.
jämförelse av avbildningstekniker (Trypanosoma brucei). Det är användbart att jämföra denna teknik med befintliga Bildtekniker med ett enda modellsystem. En sådan studie beskrivs i Fig. 4, med hjälp av parasiten T. brucei procyklisk form som sprider sig i mitten av tsetseflugan. De tre första bilderna visar befintliga avbildningsmetoder: optisk fluorescensmikroskopi (Fig., 4A), differential interferenskontrastmikroskopi (Fig. 4B ), och TEM (Fig. 4C ). Styrkan hos befintliga tekniker är uppenbar: lokaliserad märkning i fluorescens och detaljerade sektioner i TEM. Den obehandlade optiska (Fig. 4B ) och våt-SEM (Fig. 4D) bilder avgränsar cellens gränser men är låga i kontrast och saknar detaljer. Båda betonar kärnan, men andra organeller som förekommer i differentialinterferenskontrastbilden är inte tydligt identifierade, medan den våta SEM-bilden ger ut lipiddropparna till en fördel. Osmiumtetroxidfärgning (Fig., 4E) är inte lika användbar i detta system, betonar mestadels lipiddropparna och några oidentifierade inre organeller. Den starkaste bilden ses i Fig. 4F, för vilken uranylacetatfärgning användes. Fördelen med intakt bildbehandling med vilken hela cellen kan ses (tillsammans med dess fina interna strukturer som kan observeras i detalj) är uppenbar, särskilt i jämförelse med tem-bildbehandling (Fig. 4C ). Slutligen visas wet-SEM-avbildning av helcellsspecifik märkning med antikroppar mot den stora glykosylfosfatidylinositol-förankrade ytbeläggningen protein EP procyklin (10) i Fig., 4 G och H . Intressant är EP procyklin känt för att täcka hela cellen jämnt, men den observerade signalen är grupperad. Vi tillskriver detta till tendensen hos de underliggande lipidflottarna till kluster under påverkan av antikroppar, en process som fixering i formaldehyd inte kan förhindra. Guldmarkörerna belyser också cellens tredimensionella konformation på ett sätt som påminner om vilken standard SEM kan bild (en utmärkt, representativ sem-bild av T. brucei finns på http://tryps.rockefeller.edu/crosslab_intro.html).
Multimodal avbildning av T. brucei., En Cells typiska längd är 20 µm lång och 3 µm bred. A) konfokal fluorescensmikroskopi. Anti-EP procyklinantikroppar (Cedarlin) användes, och bindningen detekterades med anti-mus kopplad till fluoresceinisotiocyanat (grön). Färgning av kärnan och kinetoplasten var med propidiumjodid (röd). B) optisk (differentiell interferenskontrast) bildbehandling. C) TEM-sektioner av en cell, följt av uranylacetatfärgning, som avslöjar inre organeller. D) Wet-sem-avbildning av hela, hydrerade, ofärgade celler. E) såsom beskrivs för D med användning av osmiumtetroxidfärgning., F) enligt beskrivningen för D med uranylacetatfärgning. G) nanopartikelguldmarkörer kopplade till anti-musantikroppar, som visar placeringen av ytan EP procyklinprotein och möjliggör samtidigt en tredimensionell vy. H) högre förstoring av mittsektionen av cellen som visas i G, belyser ett område med tredimensionell helicitet i cellen.
självklart kommer TEM att ha bättre upplösning i allmänhet än våt SEM, men bilderna som presenteras i exemplet T. brucei för jämförelse är ”typiska” bilder som erhållits i samma laboratorium., Eftersom wet SEM är annorlunda i sin nytta än tem och optisk mikroskopi, i T. brucei kan det ses som en viktig komplementär förmåga, och man kan förvänta sig att hela bilden skulle ges av en kombination av optisk, TEM och wet-sem teknik.
vävnadssektioner. Våt SEM kan användas för tjocka exemplar såsom vävnadsfragment genom att helt enkelt montera provet mot membranet. Det begränsade provtagningsdjupet för BSE möjliggör avbildning av en” virtuell sektion ” som sträcker sig från ytan till ett definierat djup på upp till några mikrometer utan behov av tunn snittning.,
Fig. 5 A och B visar direkt visualisering av obehandlade vävnader från mus. Fig. 5A är en liten förstoringsbild av hjärtvävnad. Organisationen av muskelcellerna är uppenbar. Zooma in på en cell (Fig. 5B) ger en levande bild av kärnan och intracellulära organeller, eventuellt mitokondrier och deras dispersion i cellen. Såsom visas ovan för odlade celler är färgning av vävnader fördelaktig men inte absolut nödvändig och kan förbättra visualiseringen av många funktioner. Fig. 5 C och D visar en region av njur cortex hos en råtta., Färgningen (kaliumferricyanid) accentuerar den övergripande organisationen och cellkontakterna inom epitelierna i njurtubulerna. Noggrann justering av färgnings-och bildförhållanden kan avslöja olika och Kompletterande information såsom vävnadsarkitektur; t.ex. ger vävnader färgade med uranylacetat en tydlig bild av den extracellulära matrisen (data visas inte).
avbildning av vävnader. A) mushjärtat, obehandlat, avbildat direkt i provhållaren vid 30 kV. B) högre förstoring av rektangeln som visas i A., (C) rått njure dissekerades, skärs och fixerades i formalin för 24 h. vävnaden färgades sedan med 0,1% uranylacetat i 10 min. C och d visar epitelceller inom den inre ytan av tubulerna i medullärstrålarna. Gallret som stöder membranet är synligt i den här bilden. (D) förstoring av rutan som visas i C.
samtidig Fotonsamling (CL). BSE-detektion i våt SEM kan kompletteras med samtidig insamling av fotoner., Avsökningselektronstrålen exciterar molekyler i provet, som sedan kan avge ljus vid karakteristiska våglängder (CL). Ljusintensiteten används sedan för att härleda en bild av fördelningen av scintillating molekyler, antingen endogena till cellen eller etiketter som kan introduceras extraneously. Denna bild erhålls samtidigt med avbildningen av BSE vid en upplösning begränsad av elektron-Materia interaktioner och inte genom ljusspridning (6). Vi införde en ljusstyrning i vätskan under provet, som leder det emitterade ljuset till en fotomultiplikator., Denna inställning uppnår god koppling och effektiv samling av fotonerna som exciteras av elektronstrålen utan att äventyra effektiviteten av samtidig BSE-upptäckt.
Fig. 6 visar obehandlade CHO-celler, visualiseras samtidigt av BSE och fotoner. I Fig. 6A, cellgränserna är tydligt skisserade i elektronbildningsläget, och kärnan (tillsammans med dess nukleoler) är framträdande, liksom de mörka 1-µm-fläckarna runt kärnan. Dessa förekommer i cytoplasman hos alla eukaryota celler vi undersökte, och även om deras antal varierar, sprids de vanligtvis runt kärnan., I bilden CL som visas i Fig. 6B, cellens kontur och kärna är tydligt definierade, vilket indikerar en fördelning av scintillating molekyler (liknande autofluorescens) i cellen. I detta läge kännetecknas samma fläckar av ett högt utsläpp av fotoner. Kombinationen av en hög katodoluminescent signal och hög kolhalt är typisk för lipiddroppar (11), som deltar i cellens energilagring (12)., Ett oberoende test av tillsats av 200 µM oljesyra orsakade en stark proliferation av dessa droppar i cellen (data som inte visas), i överensstämmelse med uppfattningen att de observerade fläckarna är lipiddroppar.
samtidig avbildning med krossade och elektronstråle-upphetsade fotoner (CL). (A) icke-kedjad CHO-cell, avbildad genom användning av BSE enligt beskrivningen för Fig. 1D . B) avgiven ljusbild tagen samtidigt med den som visas i A.,
våt SEM har en fördel jämfört med vanliga SEM-tekniker vid bevarande av lipider, särskilt i stora aggregat som lipiddroppar. Att eliminera behovet av torkning sparar lipiderna från organiska lösningsmedel som kan lösa upp dem. Även om osmiumbehandling kommer att bevara vissa lipid bilayers, reagerar osmium i större aggregat snabbt för att skapa en yttre skorpa som inte släpper in osmium och lämnar aggregaten sårbara för efterföljande organisk lösningsmedelsbehandling., I kryogena preparat är klyvningsprocessens tendens att spricka längs lipid-vattengränser också en fara för stora lipidstrukturer.
högupplösande avbildning av markörer är en mycket önskvärd förmåga i cl-detekteringsläget, vilket kräver utveckling av etiketter för specifika molekyler i celler. I Fig. 9, som publiceras som stödjande information på PNAS webbplats, visar vi att standard fluorescerande pärlor 0,2 µm i diameter avger fotoner intensivt under elektronstrålen och kan avbildas med en upplösning på 100 nm (7)., Avbildning av mindre pärlor begränsas av låg ljusstyrka, vilket medför utveckling av specialiserade scintillationspärlor med liten diameter . Eftersom mekanismen för excitation av scintillation är starkast när strålen direkt påverkar pärlan, förväntar vi oss att detta kan förlänga upplösningen av fluorescerande bildbehandling en storleksordning utöver den som är tillgänglig med optisk mikroskopi.
