Good Mood

resultat och diskussion

Arabidopsis cDNA-biblioteket screenades med hjälp av 35S-märkt CaM-bindande screeningmetod som beskrivs (24). En av de positiva klonerna visade en identisk nukleotidsekvens till AtCat3 i databasen (GenBank anslutningsnummer. U43147). För att bevisa att AtCat3 kodade ett Kambindande protein, var det fullständiga kodningsområdet för AtCat3 underklonat i pET14b-uttrycksvektorn. Den rekombinanta AtCat3 inducerades av isopropyl β-D-tiogalaktosid (IPTG) (Fig., 1A) och renades genom Kamaffinitetskromatografi till nära homogenitet. Totalt bakterieextrakt användes för Kambindningstest, och det visades att 35S-märkta CaM binder till AtCat3-proteinet i närvaro av Ca2+ (Fig. 1A). Efter tillsats av EGTA observerades ingen Kambindning. Dessutom, 35S-märkt CaM inte binda till AtCat3 när CaCl2 ersattes av andra divalent katjoner såsom MgCl2 eller MnCl2 (Fig. 1A), vilket tyder på att CaM bindning till AtCat3 är Ca2+-beroende.

för att identifiera CaM-bindningsområdet i AtCat3 användes två C-terminal deletionsmutanter för 35S-CaM-bindningsanalyser. I närvaro av 0.,2 mM Ca2+, CaM binder till vilda typ och mutant 1-451, medan CaM inte binda till mutant 1-414 (Fig. 1b), vilket tyder på att Kambindningsområdet för AtCat3 är begränsat till aminosyror 415-451. För att ytterligare bekräfta CaM-bindning till AtCat3 inkuberades en syntetisk peptid motsvarande aminosyror 415-451 av AtCat3 med CaM. Bildandet av peptid-CaM-komplexet bedömdes av nondenaturing PAGE. 36-mer peptiden kan bilda ett stabilt komplex med CaM i närvaro av Ca2+ (Fig. 1C). I frånvaro av peptid observerades ett enda Kamband., När peptidkoncentrationen ökade uppträdde ett annat band med låg rörlighet, som representerar peptidkamkomplexet. När molförhållandet mellan peptiden och CaM var 1:1 detekterades endast peptid-cam-komplexbandet, vilket indikerar att det bara finns en CaM-bindande plats i peptiden. Inget peptidkamkomplex bildades i närvaro av EGTA (Fig. 1C). Dessa resultat indikerar att CaM specifikt binder till AtCat3 på ett kalciumberoende sätt.

katalas finns i nästan alla aeroba organismer. Hos djur finns det bara en katalasisoform kodad av en enda gen., Däremot är katalas i växter närvarande som flera isoformer kodade av en liten genfamilj (6, 26). Åtminstone är detta sant i monocots som majs och dicots som tobak, Arabidopsis och pumpa, där katalas är väl karakteriserad. Intressant har var och en av dem tre isoformer kodade av tre gener. För att avgöra om alla katalaser har Kambindande regioner jämfördes aminosyrasekvenserna av 37 katalaser från bakterier, djur och växter genom att använda pileup-programmet i gcg10-paketet., Aminosyrasekvensjämförelsen avslöjade mycket hög homologi i N-terminal 384 aa (ca 60% likhet och 50% identitet). I C-terminal 108 aa, där CaM-bindande regionen är belägen, fanns det emellertid mycket liten likhet mellan AtCat3 och andra icke-plantkatalaser (ca 21% homologi och 14% identitet). Alla växtkatalaser visade dock hög homologi i denna del (cirka 78% homologi och 70% identitet), särskilt i den region som motsvarar CaM-bindande området i AtCat3. Fig. 2 visar C-terminal 108-aa-sekvensjämförelsen av 13 representativa katalaser., Även om aminosyrasekvenserna i de karaktäriserade Kambindande proteinerna inte bevaras i Kambindningsområdet, har de flesta av dem en sekundär strukturell egenskap, den grundläggande amfifila α-helixen (27), såsom det auxinreglerade proteinet ZmSAUR1 (24) och växtens chimeric Ca2+/CaM-proteinkinas (28). Observera att det ofta finns negativt laddade aminosyror i Kambindande regioner, men nettoladdningen är positiv (16). Baserat på den spiralformade hjulprojektionen med GCG-programmet bestämdes att aminosyrorna 438-451 i AtCat3 kan bilda en grundläggande amfifil α-helix., Det är uppenbart att den ena sidan av det spiralformade hjulet är hydrofob och den andra sidan är hydrofil med netto positiva laddningar. Analys av aminosyrasekvenserna som motsvarar AtCat3: s Kambindningsregion förutspådde förekomsten av en grundläggande amfifil α-helix i några av andra växtkatalaser. Intressant, bland tre katalasisoformer i majs, tobak, Arabidopsis och pumpa, finns det minst en isoform med den amfifila α-spiralstrukturen i varje art, t. ex.,, tobacco1 (aminosyror 431-444), maize3 (aminosyror 442-455), och pumpkin1 (aminosyror 438-451), liksom Arabidopsis AtCat1 (aminosyror 438-451). Huruvida det är sant för alla växtarter är inte klart på grund av de begränsade katalassekvenserna för andra växtarter i GenBank. Baserat på kristallstrukturen data av bakteriella och däggdjurskatalaser, α-helices är de typiska strukturerna i den C-terminala delen av dessa katalaser (29), men ingen grundläggande amfifil α-spiralstruktur finns i denna del enligt spiralformad hjulprojektion.,

för att testa om CaM binder till renat katalas från planta renades tobakskatalas från bladen baserat på Durner och Klessig (10). En CaM-Sepharose-kolonn användes som det sista steget i reningsprocessen. Sammanfattningen av reningsstegen för katalas med 1 000 g tobaksblad presenteras i Tabell 1. Tobakskatalas renades till nära homogenitet enligt SDS / PAGE och silverfärgning (Fig. 3, körfält 1). Katalas identitet bekräftades genom Western blotting med en mAb mot tobakskatalas (Fig. 3, bana 3)., CaM-bindning till renat tobakskatalas visades genom följande tillvägagångssätt. i) en Kamsepharosekolonn användes för rening av tobakskatalas. Återvinningsgraden för detta steg var 81% (Tabell 1), vilket tyder på att det mesta av katalas från tobaksblad är ett Kambindande protein. (ii) 35S-märkt CaM användes för att testa bindningen till det renade katalas i närvaro av 0,2 mM CaCl2 (Fig. 3, körfält 5). Rekombinant AtCat3 användes som kontroll (Fig. 3, körfält 2, 4 och 6). Tillägg av 0.,4 mM EGTA avskaffas CaM bindande, vilket tyder på att CaM binder till anläggningen katalas i ett Ca2+-beroende sätt. Kambindningsanalyser utfördes också för att avgöra om det binder till svamp -, bovint-eller humankatalas. Resultaten visade att ingen av dessa icke-plantkatalaser visade någon Kambindning (data som inte visas), vilket överensstämmer med jämförelserna mellan aminosyrasekvensen (Fig. 2).,

CaM-bindande webbplats eller nära sammanfogade regioner i andra karakteriserade CaM-bindande proteiner fungerar ofta som autoinhibitory eller pseudosubstrate domäner. Denna region upprätthåller målproteinerna i ett inaktivt tillstånd i frånvaro av Ca2 + – signal, såsom i växt chimeric Ca2+/CaM-beroende proteinkinas (30) och glutamatdekarboxylas (31). För att studera betydelsen av Kambindning till växtkatalaser mättes katalytisk aktivitet hos rekombinant AtCat3 och renat tobakskatalas i närvaro och frånvaro av CaCl2 och CaM., Liknande experiment utfördes också genom att använda andra icke-plantkatalaser. Den E. coli-uttryckta rekombinanta AtCat3 visade ingen aktivitet. Liknande resultat erhölls i ett annat laboratorium (Zhixiang Chen, personlig kommunikation). Detta kan ha berott på att den korrekta strukturen för rekombinant katalas inte har bildats, eftersom den aktiva katalasen är en tetramer bestående av fyra identiska eller liknande underenheter (6, 10, 26). Däremot visade det renade tobakskatalaset en signifikant förändring av Ca2+/CaM-beroende aktivitet under reningsstegen (Tabell 1)., De stimulerande effekterna av Ca2+ / CaM är ungefär 2,2-faldigt i varje steg, förutom det prov som erhölls efter kam-Sepharose-kromatografi. Det visade en högre stimulering av katalasaktiviteten (2,5 gånger) möjligen på grund av avlägsnandet av icke-Ca2+/CaM-bindande katalasfraktion (Tabell 1). Den icke-Ca2+/CaM-bindande katalasfraktionen hade en specifik aktivitet på 59, 6 enheter (basal aktivitet). Ca2 + / CaM stimulerar emellertid inte aktiviteten hos denna fraktion av katalas (data visas inte)., Dessa resultat tyder på att Ca2+/CaM kan aktivera tobakskatalaset i den fraktion som erhölls efter CaM-Sepharose-kromatografi, vilket motsvarar Kambindningsresultaten. För att jämföra effekterna av Ca2 + /CaM på katalasernas aktivitet från olika källor användes den relativa aktiviteten, eftersom det finns signifikant skillnad i katalasernas specifika aktivitet från olika arter. Till exempel har A. niger-katalas den specifika aktiviteten av 5,7 enheter; bovint leverkatalas, 51,9 enheter; humana erytrocyter, 39,5 enheter; tobakskatalas, 63.,1 enheter (i avsaknad av Ca2+/CaM). Fig. 4A visar att enbart CaCl2 eller CaM inte hade någon stimulerande effekt på tobakskatalasaktiviteten (cirka 40% av den maximala aktiviteten). Ingen skillnad i katalytisk aktivitet observerades i svamp -, bovin-eller humankatalaser i närvaro eller frånvaro av Ca2+, CaM och Ca2 + / CaM (Fig. 4A). Genom att ersätta CaCl2 med MgCl2 skedde ingen signifikant förändring av tobakskatalasaktiviteten i närvaro eller frånvaro av CaM (data visas inte)., För att ytterligare dokumentera effekten av Ca2 + /CaM på växtkatalasaktivitet tillsattes 10 µM av peptiden motsvarande Atcat3-Kambindningsområdet (415-451) till varje reaktionsblandning. Nonplantkatalaser påverkades inte av tillsatsen av peptiden. Emellertid avskaffades den stimulerande effekten av Ca2+/CaM på tobakskatalasaktivitet genom tillsats av peptiden (Fig. 4A). Dessutom berodde den hämmande effekten av peptiden på tobakskatalasaktiviteten på koncentrationen av peptiden (Fig. 4B)., Katalasaktiviteten hämmades med cirka 58%, vilket ligger nära katalas basala aktivitet. Peptiden hade emellertid ingen effekt på aktiviteten hos bovinkatalas vid alla testade koncentrationer (Fig. 4A). Dessa resultat tyder på att Ca2+ / CaM har en stimulerande effekt på det renade växtkatalaset, men har ingen effekt på de icke-vegetabiliska katalaserna.

det är känt att katalas är ett övervägande peroxisomalt enzym, men det finns också i mitokondrier och cytoplasma (32). Till exempel är majs Cat3, som kan vara ett Kambindande katalas baserat på aminosyrasekvensjämförelse, ett mitokondriellt protein (33). Våra resultat (fikon. 1-4) visa att CaM binder till växtkatalas och reglerar dess aktivitet. För att visa närvaron av denna reglerande aktivitet in vivo studerade vi huruvida CaM samexisterar med katalas i växternas peroxisomer., Organeller från etiolerade pumpa cotyledon extrakt separerades av sackarostäthet centrifugering. För att avlägsna kontaminationen av cytosolproteiner som kan finnas i lösningen eller bara associeras med peroxisomalmembranet behandlades de isolerade peroxisomerna med proteinas K. på detta sätt smältes inte peroxisomalproteinerna avskärmade från proteas av peroxisomalmembranet (34, 35). Identiteten hos de peroxisomala fraktionerna visades genom att mäta katalasaktiviteten (35)., CaM är mycket bevarad över riken (13-16), därför gjorde vi västerländsk analys med en anti-human cam antikropp. Som en kontroll användes den rekombinanta potatiskammen PCM6 (Fig. 5, bana 3). Intressant var ett band i en storlek som liknar PCM6 närvarande i peroxisomalfraktionerna, men intensiteten var betydligt lägre jämfört med cytosolisk kam (Fig. 5). Dessa resultat indikerar att CaM och katalas är colocalized i peroxisomerna. CaM är ett litet surt protein som främst uttrycks i cytoplasman., I växter har emellertid CaM visat sig vara närvarande i flera organeller, såsom kärnan och kloroplasterna (36, 37) och extracellulär matris (38). Kamreglerade proteiner finns också i extracellulär matris, kärna och kloroplaster (38-40). Hur CaM korsar membranet är inte klart. Nyligen genomförda studier visar att posttranslationella modifieringar spelar en roll i översättningen av vissa CaM isoformer. Till exempel är ett petunia CaM-liknande protein, CaM53, associerat med plasmamembran när proteinet är prenylerat. Om prenylering hämmas finns CaM53 övervägande i kärnan (41).,

vi vet att det inte finns någon rapport som diskuterar kalciumkoncentrationen i peroxisomerna., Baserat på en nyligen modifierad modell av peroxisombiogenes härstammar peroxisomet från endoplasmatisk retikulum (ER) med hjälp av preperoxisomala vesiklar (42). Det är känt att ER är en av de intracellulära kalciumpoolerna. Således kan kalciumkoncentrationen i peroxisomer vara lika hög som i ER. Mätning av peroxisomal kalciumkoncentration och övervakning av varje samband mellan förändring av kalciumkoncentrationen i cytoplasman och peroxisom bör bidra till vår förståelse av hur peroxisomalkatalas regleras av Ca2+/CaM., Till exempel kan den fria kalciumkoncentrationen mätas i de transgena växterna med det rekonstituerade aequorin med en peroxisominriktningssignal. Aequorin är ett kalciumkänsligt luminescerande protein, vars luminiscens direkt rapporterar kalciumförändringen (43). Eftersom peroxisom är en viktig organell som avlägsnar de toxiska ROS, främst H2O2, är det rimligt att spekulera om att peroxisomala katalas aktivitet förblir hög hela tiden för att försämra H2O2 in situ i snabb takt. Fluktuationer i det cytosoliska kalciumet kan dock ha stor effekt på cytosolisk katalasaktivitet., Det är viktigt att betona att inte alla katalaser är Kambindande proteiner. Därför behövs ytterligare undersökningar för att ta itu med betydelsen av Ca2+/CaM vid kontroll av katalasaktivitet i olika organeller.

biotiska och abiotiska påfrestningar utlöser en Ca2 + tillströmning, och den ökade cytosoliska Ca2+ stimulerar produktionen av H2O2, som diffunderar in i omgivande celler som en budbärare och inducerar det fysiologiska svaret (19, 20). Våra resultat tyder på att ökad cytosolisk Ca2 + kan minska H2O2-nivåer med hjälp av Ca2 + /CaM-medierad stimulering av katalasaktivitet (Fig. 4)., Vi föreslår att ökad cytosolisk Ca2 + har dubbla roller för att reglera H2O2 homeostas (Fig. 6): (jag) positiva förordning genererar H2O2 genom att direkt aktivera NADPH oxidas, som har affinitet till Ca2+ (22) och indirekt producerar mer NADPH med hjälp av Ca2+/CaM-reglerade NAD kinas (23); och (ii) negativa förordning minskar H2O2 genom att stimulera katalas verksamhet genom att Ca2+/CaM-modulering (Fig. 4)., Signalinducerade förändringar i Ca2 + transienter kan variera i frekvens, varaktighet, amplitud och rumslig lokalisering av oscillationer och läge för rumslig förökning, vilket leder till differentialeffekter på kalciummålproteinerna (12, 44).