Good Mood

Auswirkungen von rbST auf Milchleistung

Tabelle 2 zeigt eine Zusammenfassung der Milchleistung für den rbST-und Kontrollgruppe ausgedrückt als Mittelwert und die Standardabweichung der Milch-Produktion (Kg pro Tag) an jedem Behandlungszyklus, als auch die Produktion der Unterschied zwischen den beiden Gruppen (% extra produzierte Milch von rbST-Gruppe im Vergleich zu kontrolltieren)., Von Zyklus 0 bis Zyklus 3 scheint die Milchproduktion in beiden Gruppen zuzunehmen, was möglicherweise darauf hindeutet, dass die Tiere ihren Höhepunkt der Laktation noch nicht erreicht haben. Obwohl die erste Dosis von rBST etwa 2 Monate nach der Geburt verabreicht wurde, wie vom Hersteller empfohlen, ist es wichtig zu beachten, dass diese Empfehlung auf mathematischen Modellen basiert, die den Milchproduktionssprung bei 60-90 Tagen nach der Geburt lokalisieren., Diese Modelle sind jedoch nur theoretische Ansätze und Tage in der Milch (DIM) auf dem Milchgipfel weisen eine große Variation zwischen Herden und Kühen auf, die unter anderem durch Wohlergehen und Fütterung bedingt ist37. Vom Zyklus 4 bis zum Ende der Studie konnte ein Rückgang der Milchproduktion von Kontrollkühen beobachtet werden, während die mit rBST behandelten Tiere ihre Produktion auf 30-35 kg Milch pro Tag relativ konstant zu halten schienen, was eine offensichtliche abnehmende Tendenz zeigte nur wenn die Hormonbehandlung gestoppt wurde (Zyklen 14, 15 und 16)., Zu diesem Zeitpunkt kehrten die zwischen den Gruppen beobachteten Produktionsunterschiede auf ein Niveau zurück, das denen von Zyklus 0 sehr nahe kam. Es ist bemerkenswert, dass die Milchproduktion in der rBST-Gruppe während der gesamten Studie signifikant höher war als in der Kontrolle, außer während Zyklus 6, als diese Tiere nur 5% mehr produzierten als Kontrollpersonen (Tabelle 2). Auf der Grundlage des vom Hersteller empfohlenen zweiwöchigen Verabreichungsmusters von rBST hätte die Gruppe der behandelten Tiere am Tag 70 eine neue Dosis rekombinantes Wachstumshormon erhalten sollen., Diese Dosis wurde jedoch nicht angewendet, um beurteilen zu können, ob die rBST-Gruppe das Transkriptionsprofil vor der Dosis nach 28 Tagen ohne hormonelle Verabreichung wiederherstellen konnte (Abb. 1). Möglicherweise aufgrund dieses Hormonmangels verschwanden die statistisch signifikanten Unterschiede in der Milchproduktion zwischen den beiden Gruppen, was die Auswirkungen von rBST auf die Milchproduktionsraten hervorhob (Tabelle 2). Am Tag 84 wurde rBST erneut verabreicht und die signifikanten Unterschiede in der Milchproduktion zwischen den beiden Gruppen traten wieder auf (24%)., Bei Zyklus 12 wurde ein maximaler Unterschied von 43% mehr Milch bei behandelten Tieren in Bezug auf Kontrollkühe beobachtet, der sich sowohl auf eine aufrechterhaltene Produktion aufgrund von rBST als auch auf ein natürliches abnehmendes Muster bei Kontrollfrauen bezog. Seltsamerweise wurden diese signifikanten Unterschiede bis zum Ende der Studie beibehalten, sogar fast zwei Monate nach der Verabreichung der letzten Dosis (12.

RNA isolation from bovine somatischen Zellen

MSCs sind einfach zu sammeln, die Quelle der RNA-genexpressions-Studien, da diese Zellen isoliert werden können, die aus Rohmilch folgenden ein sehr einfaches Protokoll. Außerdem ist die Probenentnahme billig und nicht-invasiv, da Milch im Melkraum ohne direkten Kontakt mit dem Tier und daher ohne Stress gesammelt werden kann, der die erzielten Ergebnisse verändern könnte. In dieser Studie hatte die rBST-Behandlung keinen signifikanten Effekt (P = 0.,099) über die Menge der aus MSCs isolierten RNA mit einer mittleren Konzentration von 120,69 ± 68,31 µg mL−1 in Proben der rBST−Gruppe und 132,36 ± 68,86 µg mL-1 in Proben der Kontrollgruppe. Der mittlere A260 / 280-Verhältniswert betrug 1.766 ± 0.095. Es ist möglich, dass ein Reinigungsschritt mit Spinsäulen das Verhältnis A260/280 und damit die Reinheit der RNA-Proben erhöhte. Obwohl die Einbeziehung dieses Schritts den Probenpreis in die Routineanalyse erhöht, können Proben mit höherer Reinheit erhalten werden. Der für die analysierten Proben beobachtete mittlere RIN-Wert betrug 6,88 ± 0.,82 Einige Faktoren könnten die Integrität der Proben beeinflussen. Die in dieser Studie verwendeten Proben waren somatische Rinderzellen, die aus Milch isoliert wurden. Milch zeichnet sich durch eine komplexe Mikrobiota aus und RNasen, die von dieser Mikrobiota abgeleitet sind, könnten für eine geringere RNA-Integrität verantwortlich sein. Darüber hinaus könnten einige der in der Milch vorhandenen somatischen Zellen teilweise abgebaut werden. Diese Tatsachen wurden auch in einer Studie beobachtet, in der Rinder-Vaginalabstrich für Transkriptomikstudien mit dem Ziel verwendet wurde, Biomarker zu finden, um den Missbrauch anaboler Wirkstoffe nachzuvollziehen38., Auch der Prozess des Melkens, der Milchsammlung und des Transports zum Labor könnte, obwohl er so schnell wie möglich durchgeführt wird, die RNA-Integrität beeinträchtigen.

Wirkung von rBST auf somatotrope Achsengene

Für die Gestaltung der in dieser Studie verwendeten OpenArray® – Platten wurde ein Satz von 18 Genen (Tabelle 1) ausgewählt. Diese Selektion basierte auf dem Potenzial dieser Gene, eine charakteristische rBST-Transkriptomsignatur zu erhalten, die als Standard zur Kontrolle der ab(Verwendung) von rBST bei Milchvieh verwendet werden konnte., Frühere Genexpressionsstudien mit rBST wurden als Einzeldosis-und Einzelprobenentnahmestudien in postmortalen Brustgeweben27 oder Mehrdosis-Studien (fünf Dosen) mit Blut-und Muskelentnahme in vivo31 konzipiert. Diese Methoden gelten als invasiv, relativ teuer und daher für Kontrollzwecke in Milchviehbetrieben unpraktisch. Im Falle von Somatotropin muss die Kontrolle in vivo durchgeführt werden, da das ultimative Ziel darin besteht, den Eintritt von rBST-Milch in den Milchmarkt zu vermeiden.,

In dieser Studie wurde die Expression von IGF-1 nur an allen Probenpunkten bei einer mit rBST behandelten Kuh (Kuh 7) nachgewiesen und war in den MSCs der Kontrollgruppe nicht nachweisbar. Die Tatsache, dass es nur möglich war, das IGF-1-Ziel an allen Stichprobenpunkten einer Kuh nachzuweisen, kann auf das Vorhandensein verschiedener lokaler Brustdrüsenreaktionen auf exogene rBST bei Individuen hinweisen. Die meisten im Kreislauf gefundenen IGF-1-Moleküle sind mit hoher Affinität an eines oder mehrere der sechs bekannten IGF-1-Bindungsproteine (IGFBP–1-6) gebunden, die die Bioverfügbarkeit von IGF-1 in Zielgeweben39 modulieren., Frühere Studien haben beobachtet, dass rBST die Upregulation von IGFBP-5 im Skelettmuskel von Cattle31 stark beeinflusst und IGFBP-3 im Brustgewebe herunterreguliert32. In dieser Studie wurden jedoch zu keinem Zeitpunkt Transkripte von IGFBP-3 oder IGFBP-5 nachgewiesen. Dieses Ergebnis könnte darauf zurückzuführen sein, dass MSCs hauptsächlich aus Leukozyten40 bestehen, bei denen die repressive Wirkung von IGFBP möglicherweise nicht so wichtig ist wie im Brustgewebe. Daher werden in dieser Studie sowohl IGF-1-als auch IGF-1-Bindungsproteine als potenzielle Marker in somatischen Zellen verworfen.,

Eine weitere Schlüsselkomponente der somatotropen Achse ist der IGF-1-Rezeptor (IGF-1R), der der primäre Signalrezeptor für IGF-1 ist, der die meisten seiner biologischen Wirkungen vermittelt. Am Tag 1 hatte die rBST-Gruppe (0,348 ± 0,131) eine signifikant (P < 0,001) höhere relative Häufigkeit von IGF-1R als die Kontrollgruppe (0,0898 ± 0,0486). Verschiedene Studien, die die Konzentration von rBST im Blut nach der Verabreichung untersuchten, beobachteten, dass die höheren Konzentrationen dieses rekombinanten Hormons nach der Verabreichung von rBST gefunden wurden14,15., Daher könnten die signifikanten Unterschiede, die in der behandelten Gruppe beobachtet wurden, als Reaktion auf das IGF-1, das als Reaktion synthetisiert wurde, auf die höheren Konzentrationen von rBST bei behandelten Kühen nach der ersten Dosisverabreichung zurückzuführen sein. In Abb. 2 kann beobachtet werden, dass die relative Häufigkeit von IGF-1R für die beiden ersten Zyklen der rBST-Verabreichung auch in der rBST-Gruppe signifikant höher war als in der Kontrollgruppe an vielen Stichprobenpunkten. Seltsamerweise war die relative Häufigkeit von IGF-1R am Tag 84 der Studie in der rBST-Gruppe (0,070 ± 0,057) und in der Kontrollgruppe (0,110 ± 0,030) ähnlich., Dieser Tag fiel mit der sechsten Verabreichung von rBST zusammen, und zwischen dieser Dosis und der fünften Dosis bestand eine Lücke von 28 Tagen anstelle von 14 Tagen. Daher ist es möglich, dass die rBST-Gruppe das physiologische Niveau von IGF-1R nach mehreren Tagen ohne rBST wiederherstellte und sogar die Auswirkungen der Abwärtsregulation auf die IGF-1R-Transkription zeigte. Diese Ergebnisse zeigen, dass IGF-1R ein möglicher guter Kandidat für die Aufnahme in ein Genpanel ist, um die Verwendung von rBST in Milchviehbetrieben nachzuweisen., Obwohl andere Autoren keinen signifikanten Effekt von rBST auf IGF-1R-Spiegel in Skelettmuskelzellen fanden, wurde in dieser Studie eine klare Reaktion in den Spiegeln dieses Rezeptor-Transkripts in MSCs beobachtet. In diesem Sinne können Leukozyten,Neutrophile und Monozyten Wachstumshormon und IGF-1 produzieren und ihre Rezeptoren exprimieren, die darauf hinweisen, dass IGF-1/IGF-1R-Signalwege regulatorische Funktionen auf das Immunsystem ausüben können, einschließlich der Proliferation41, 42. Der Unterschied zwischen den beiden Studien könnte sein, aufgrund der verschiedenen Matrizen verwendet., MSCs könnten möglicherweise besser auf die höheren zirkulierenden IGF-1-Spiegel reagieren und die Anzahl der Rezeptoren für dieses Molekül in ihrer Membran erhöhen

Wirkung von rBST auf immunsystembezogene Gene

Tumornekrosefaktor (TNF) und Interleukin-1β (IL-1β) sind zwei Zytokine, die eng mit dem Immunsystem43 verwandt sind., Aufgrund ihrer Beziehung war es vermutlich möglich, ähnliche Trends in der relativen Häufigkeit von TNF-und IL-1β-Transkripten während der gesamten Studie zu identifizieren. Die rBST-Verabreichung führte zu einem signifikanten Anstieg der relativen Häufigkeit von TNF-und IL-1β-Transkripten. Erwähnenswert ist, dass an den Tagen 9, 23 und 35 die relativen Häufigkeiten von TNF und IL-1β in der rBST-Gruppe im Vergleich zur Kontrollgruppe signifikant höher waren (Abb. 3). Diese Tage entsprechen der zweiten Woche der rBST-Zyklen, ungefähr 7-9 Tage nach Injektionen von Lactotropina®., Daher ist es möglich, dass die transkriptomischen Veränderungen, die durch rBST in diesen beiden Zytokinen verursacht werden, in der zweiten Woche eines rBST-Zyklus offensichtlicher sind. Seltsamerweise gab es am Tag 84 (28 Tage nach der 5.rBST-Verabreichung) keine signifikanten Unterschiede zwischen den Gruppen (Abb. 3). In diesem Zusammenhang haben andere frühere Studien leistungsstarke transkriptomische Technologien verwendet,um die Verwendung von anabolen Wirkstoffen in Cattle26, 38 zu erkennen., Diese Studien beobachteten auch eine erhöhte Transkription von IL-1β, von denen eine signifikant war26, und dies ist sehr interessant, da in der genannten Studie Blutzellen verwendet wurden,deren Zusammensetzung der von MSCs sehr ähnlich ist, da sie einen hohen Anteil an weißen Blutkörperchen aufweisen. Die zuvor genannten Studien fanden jedoch keine Wirkung von anabolen Wirkstoffen auf TNF, während die vorliegende Forschung einen starken Einfluss der rBST-Verabreichung auf die relative Häufigkeit von TNF fand., In diesem Zusammenhang wurde berichtet, dass die exogene Verabreichung von rBST während der Stillzeit die Immunantwort bei Kühen verstärken kann44. Tatsächlich nahmen die somatischen Zellzahlen von Milch früher und schneller bei Kühen zu, die an coliforme Mastitis litten, als rBST verabreicht wurde45. Wachstumshormon und seine rekombinante Version zeigen die Fähigkeit, die Entzündungsreaktion und die neutrophile Abwehr der laktierenden Brustdrüse von Rindern bei gesunden und erkrankten Kühen zu modulieren45. Dies könnte die Hochregulierung von TNF und IL-1β bei rBST behandelten Kühen erklären.,

In Screening-Studien unter Verwendung von Transkriptomik ist es sehr schwierig, ein spezifisches Gen zu finden, das als sehr spezifisches Gen verwendet werden könnte. Es ist anzumerken,dass sowohl IL-1β als auch TNF in anderen Prozessen als subklinische Mastitis hochreguliert werden können46, 47. Verschiedene in den Vereinigten Staaten durchgeführte Studien haben gezeigt, dass große Betriebe eher rBST einführen,was nicht nur auf eine potenzielle Komponente der rBST-Nutzung und-Rentabilität, sondern auch auf eine Betreiberkomponente (Alter und Bildung) hindeutet48, 49., Rekombinantes Somatotropin wurde häufig als managementintensive Technologie gemeldet, die mit der Verwendung anderer produktivitätsorientierter Technologien und Managementpraktiken verbunden ist,die für größere Betriebe charakteristisch sind und bei Grazern seltener sind49, 50. In diesem Sinne verursacht subklinische Mastitis eine Verringerung der Milchproduktion bei betroffenen Kühen51. Daher sollte es interessant sein, die Daten transkriptomischer Assays mit den Daten zur Milchproduktion zu kombinieren., Es könnte auch von einem mikrobiologischen Milchtest bei Verdacht auf Kühe begleitet werden, um die Hauptpathogene im Zusammenhang mit subklinischer Mastitis nachzuweisen. Aber was das Potenzial für Diskriminierung wirklich erhöht, ist die Einbeziehung von mehr Genen in das Panel.

Wirkung von rBST auf Zellzyklus, Proliferation, Differenzierung und Adhäsion

Es ist bekannt, dass rBST die Milchsynthese durch Erhöhung des Umsatzes (Proliferation/Apoptose) und der Aktivität von Milchepithelzellen erhöht, was darauf hinweist, dass rBST Stoffwechselwege beeinflusst, die den Zellumsatz/ – zyklus und den Metabolismus regulieren52., Der Zellzyklus wird durch Cycline und Cyclin-abhängige Kinasen gesteuert. Von diesen koordiniert Cyclin D (durch das CCND1-Gen endodiert) die Zellzyklusprogression durch extrazelluläre Stimulation (z. B. Wachstumsfaktor, Nährstoffverfügbarkeit) und treibt die G1-zu-S-Phasenprogression an, was zu einer Zellmitose führt. Die meisten adulten Zellen werden jedoch in einem Ruhezustand gehalten, der als G0-Phase bekannt ist, einem Ruhezustand, und sie können unter geeigneten mitogenen Reizen in den Zellzyklus in der G1-Phase wieder eintreten53. In dieser Studie wurde beobachtet, dass die rBST-Behandlung die CCND1-Transkription stark beeinflusst., Vor der ersten rBST-Dosis gab es keine signifikanten Unterschiede zwischen der Kontroll-und der rBST-Gruppe (Abb. 3). Nach der ersten Dosis konnten jedoch signifikante Unterschiede zwischen den beiden Gruppen an verschiedenen Probenpunkten beobachtet werden. Die relative Häufigkeit von CCND1 war in der rBST-Gruppe signifikant höher als in der Kontrollgruppe in den beiden ersten Zyklen der rBST-Behandlung (Abb. 2). Dieser Effekt scheint 9 Tage nach der rBST-Verabreichung besonders offensichtlich zu sein, ähnlich wie bei TNF-und IL-1β-Transkripten., Somit war an den Tagen 9, 23 und 35 der Studie die relative Häufigkeit von CCND1 in der rBST-Gruppe signifikant höher als in der Kontrollgruppe (Abb. 3). Schließlich gab es am Tag 84 (28 Tage nach der 5.rBST-Verabreichung) keine signifikanten Unterschiede zwischen den Gruppen (Abb. 3) wie im Fall der Zytokine. Auch am letzten Tag (219) der Probenahme (51 Tage nach den letzten rBST-Dosen) gab es keine signifikanten Unterschiede (P > 0.05) zwischen der rBST-Gruppe (0.433 ± 0.141) und der Kontrollgruppe (0.430 ± 0.178)., Daher verursacht die exogene Verabreichung von rBST eine Überexpression von CCND1. Dies kann zur Aktivierung der Zelle in der G0-Phase und im speziellen Fall des Brustgewebes zu einer Erhöhung der Milchproduktion durch Erhöhung der Anzahl der Alveolarzellen der Milchdrüse führen54.

Andere Gene, die mit dem Zellzyklus zusammenhängen, sind Tumorprotein D52-like 2 (TPD52L2) und Sirtuin 2 (SIRT2). In ähnlicher Weise wie bei CCND1, TNF und IL-1β war es möglich, eine signifikant höhere (P < 0.001) relative Häufigkeit von SIRT2-Transkripten in der rBST-Gruppe zu finden (1.,517 ± 0,199) als in der Kontrollgruppe (0,506 ± 0,250) am Tag 23 der Studie, in diesem Fall jedoch nur während des zweiten Zyklus der rBST-Verabreichung (Abb. 4). Die erhöhten Konzentrationen von CCND1 – und SIRT2-Transkripten nach der zweiten Verabreichung von Lactotropina® in der behandelten Gruppe könnten das Ergebnis einer Wirkung von exogener rBST auf den Zellzyklus sein. Die Zirkulation dieses Peptidhormons im Organismus würde zur Aktivierung des Zellzyklus in den Zielzellen führen., In den anderen rBST-Zyklen war der Zusammenhang zwischen der Dosisverabreichung und Änderungen der relativen Häufigkeit von SIRT2-Transkripten jedoch nicht so offensichtlich wie in der zweiten Dosis. Zusätzlich zu dem Vorstehenden ist es bemerkenswert, dass die behandelte Gruppe während 4 Tagen nach der ersten rBST-Verabreichung eine signifikant höhere relative Häufigkeit von TPD52L2-Transkripten (P < 0.05) aufwies. Eine weitere Komponente, die durch ihre relevante Rolle bei der Translation am Zellstoffwechsel beteiligt ist, ist der eukaryotische Elongationsfaktor 1 gamma (EEF1G).,

In dieser Studie folgte die relative Häufigkeit von EEF1G-Transkripten keiner offensichtlichen Tendenz im Zusammenhang mit der rBST-Verabreichung., An den Tagen 17 und 30 (3 und 2 Tage nach der zweiten bzw. dritten rBST-Dosis) war die relative Häufigkeit von EEF1G-Transkripten in der rBST-Gruppe jedoch signifikant höher. Eine frühere Studie27 kam zu dem Schluss, dass die rBST-Behandlung die EEF1G-Transkripte im Brustgewebe erhöht, jedoch nur einen Probenpunkt 6 Tage nach der Verabreichung von Somatotropin verwendet. Daher ist es nicht möglich, diese Ergebnisse direkt mit den Ergebnissen dieser Studie zu vergleichen, in der 36 Stichprobenpunkte für transkriptomische Assays im Verlauf von 8 Monaten verwendet wurden., Ein weiteres Gen, das in dieser Studie enthalten ist, ist Milchfettkügelchen-EGF-Faktor-8-Protein (MFGE8). In Abb. 4 ist es möglich zu beobachten, dass die relative Häufigkeit von MFGE8 in der rBST-Gruppe eine große Variabilität zwischen den Stichprobentagen aufwies. Insbesondere, McCoard et al.27 beobachtete, dass 6 Tage nach der Verabreichung von rBST die relative Häufigkeit von MFGE8 im Rindermilchgewebe höher war. Wie bereits erwähnt, umfasste diese Studie jedoch nur einen Datenpunkt nach einer einzelnen rBST-Dosis., Das vorliegende Langzeitexperiment mit mehreren Dosen hat gezeigt, dass Transkriptionsmuster bei Rindern, die mit rBST behandelt wurden, im Laufe der Zeit eine große Variabilität aufweisen. Zum Beispiel zeigten Daten, die für CCND1 erhalten wurden, dass die Wirkung von rBST auf die Transkription einiger Gene mit der Anzahl der Dosen zunimmt. Obwohl es möglich ist, dass rBST die Transkription des MFGE8 – Gens beeinflusst, zeigten die erhaltenen Ergebnisse sowohl eine Auf-als auch eine Abwärtsregulation., Daher kann MFGE8 nicht als idealer Kandidat für die Verfolgung der rBST (ab) – Verwendung bei Rindern vorgeschlagen werden, da es nicht möglich war, eine klare Tendenz in seiner Transkription zu beobachten. Ein weiteres Gen im Zusammenhang mit der Zelladhärenz, das in dieser Studie untersucht wurde, ist Catenin alpha-like 1 (CTNNAL1). Es war jedoch nicht möglich, signifikante Unterschiede in der Transkription als Folge der rBST-Verabreichung zu finden.

Andere Gene

Lactoferrin (LTF) ist ein eisenbindendes Glykoprotein, das zur Transferrinfamilie gehört55., Abbildung 4 zeigt die Entwicklung der LTF-genrelativen Häufigkeiten an allen in dieser Studie untersuchten Stichprobenpunkten. Obwohl in früheren Studien mit anabolen Substanzen in cattle38 eine Hochregulierung der LTF beobachtet wurde, war es nicht möglich, eine klare Tendenz zur LTF in Bezug auf die rBST-Behandlung festzustellen. Beispielsweise ist an den Tagen 9 und 53 die relative Häufigkeit von LTF bei rBST-behandelten Tieren geringer. Am Tag 91 war die relative Häufigkeit in dieser Gruppe jedoch erheblich höher. Es ist notwendig, die Ergebnisse für das Kollagen Typ III α 1 (COL3A1) – Gen zu diskutieren., Eine frühere Studie kam zu dem Schluss, dass Behandlungen mit rBST bei Milchvieh 6 Tage nach der rBST-Verabreichung eine Hochregulierung des COL3A1-Gens im Brustgewebe verursachen27. In der vorliegenden Arbeit war es jedoch nicht möglich, Transkripte des COL3A1-Gens nachzuweisen. Auch die ESR2-Transkription wurde in dieser Studie nicht nachgewiesen.

Ein panel der Gene zu überwachen rbST (ab -) Nutzung in der Milchviehhaltung

Das Letzte Ziel dieser Arbeit war es, einen Vorschlag für eine routine-panel der Gene, deren kombinierte Transkription Muster würden es ermöglichen, die Entwicklung einer screening-Methode zur Kontrolle des Missbrauchs von rbST in Milch-Farmen über MSCs., Im Gegensatz zu anderen früheren Studien27, 31, 32, Diese Arbeit analysierte die Transkriptionsmuster von rBST-verwandten Genen in einem 8-monatigen Real-Conditions-Experiment mit 12 Zyklen der rBST-Verabreichung und Kontrolltiere. Dieser Ansatz ermöglichte es, genauere Daten zu erhalten, um zwischen rBST-behandelten Kühen und Kontrollkühen zu unterscheiden.

Multivariate statistische Analysen wurden durchgeführt, um Modifikationen in MSCs-Transkriptionsmustern als Folge der rBST-Verabreichung aufzuklären., Zu diesem Zweck wurde nur das Transkript der neun Gene verwendet, die während des gesamten Experiments erfolgreich gemessen wurden (IGF1R, CCND1, TNF, IL1ß, SIRT2, EEFG1, MFEG8, LTF, TDP52L2), mit Ausnahme derjenigen Gene, die nur in sehr wenigen Fällen/Proben exprimiert wurden. Das Hauptziel der PCA-Analyse ist es, globale Muster in Daten zu identifizieren und die Korrelation zwischen verschiedenen Variablen zu erkennen, d. H. In diesem speziellen Fall Transkriptionen verschiedener Gene., Die Projektion der Proben in den neuen mehrdimensionalen Raum der Hauptkomponenten (PCs) würde möglicherweise eine Differenzierung zwischen rBST und Kontrollgruppen ermöglichen und auch jene Gene hervorheben, die eine größere Fähigkeit als Biomarker der Behandlung haben. Im Score-Diagramm der PCA-Analyse in Abb. 5 konnte eine Gruppierungstendenz in den beiden Gruppen von MSC-Proben ersichtlich werden, wobei rBST-behandelte Tiere als rote Kreise und Kontrolltiere als Black Boxes identifiziert und entsprechend dem Versuchstag gekennzeichnet wurden., Verschiedene Proben der rBST-Gruppe erschienen gemischt mit Kontrollen auf der linken Seite des Diagramms, aber seltsamerweise entspricht die Mehrheit von ihnen einem Tag der Somatotropin-Verabreichung (Tage 14, 28, 57 oder 84) oder den ersten 2-3 Tagen nach einer Dosis (Tage 2, 3, 17, 44 oder 115), bei denen keine offensichtliche transkriptomische Störung festgestellt wurde. Im Gegenteil, nur sehr wenige Kontrolltiere konnten als behandelte Kühe auf der PCA klassifiziert werden, und ihre Situation erklärt sich durch extreme Werte, insbesondere durch schlecht diskriminierende Gene wie LTF, MFGE8 oder SIRT2.,

Die transkriptomischen Profile wurden ebenfalls einem OPLS-DA unterworfen, aus dem auch auf potentielle diskriminierende Gene hingewiesen wurde. In Abb. 6a wird die visuelle Darstellung des multivariaten Modells gezeigt, wobei MSC-Proben von Kontrolltieren als schwarze Quadrate und Proben aus der rBST-Gruppe als rote Kreise dargestellt sind. In ähnlicher Weise wie PCA werden mehrere rBST-Samples zwischen Kontrollproben auf der linken Seite der Ellipse projiziert., Diese Proben wurden jedoch gesammelt, als die durch rBST verursachte transkriptomische Störung verschwunden war (oder noch nicht aufgetreten war), so dass sie streng genommen in diesem bestimmten Moment als Kontrollen klassifiziert werden konnten. Umgekehrt wurden nur sehr wenige Kontrollproben als rBST falsch klassifiziert. Wenn kein Testsatz verfügbar ist, wie dies hier der Fall ist, ist die Kreuzvalidierungsmethode die Hauptstrategie zur Beurteilung der Qualität eines Modells. Die Ergebnisse des Kreuzvalidierungsverfahrens werden durch den Wert verschiedener Qualitätsparameter zusammengefasst., In dieser Studie zeigte das OPLS multivariate Modell die folgenden Eigenschaften: R2 (X) = 0,6, R2(Y) = 0,4 und Q2 = 0,3. Das Modell erklärt 60% der Variation im x-Raum und 40% der Variation im y-Raum, und die Güte der Vorhersage beträgt 30%. Diese Werte geben eine relativ gute Beschreibung der Daten durch das Modell und die durchschnittliche Vorhersagbarkeit34 an. Der aus der CV-ANOVA berechnete p-Wert betrug 3,01 × 10-7, was auf signifikante Unterschiede zwischen den beiden Klassen des Modells hindeutet., Die Tatsache, dass dieses Modell mit einem Panel von Genen mit unterschiedlicher Unterscheidungsfähigkeit gebaut wurde, sollte nicht ignoriert werden, da es die Unterscheidungskraft der OPLS beeinflusst. Außerdem verzerren diese experimentellen Tage mit sehr wenig oder keinem rBST-Effekt auf ihre Transkripte definitiv das Modell, da sie in der Praxis zu einer Gruppe gehören, aber als die andere fungieren., In zukünftigen multivariaten Screening-Modellen muss ein Panel ausgewählter hochdiskriminierender Gene verwendet werden, und vorzugsweise gehören „bekannte“ und „unbekannte“ Proben, die in das multivariate Modell projiziert werden sollen, zu ähnlichen Populationen (Alter, Rasse usw.).) und Laktationsmomente, in einem Versuch, die interindividuelle Variabilität der Tiere zu überwinden35. Bei dieser Art von Ansätzen ist es auch wichtig, dass die prädiktive Population größer ist als die vorhergesagten Proben. Schließlich wurden die Gründe für die Diskriminierung auf dem OPLS-DA im entsprechenden S-Plot untersucht (Abb., 6b), der den Beitrag jeder Variablen (Gentranskription) zur Trennung der beiden Stichprobenklassen offenbarte. Wie in früheren Abschnitten kommentiert, wurde die diskriminanteste Transkription in MSC in CCND1 -, IGF-1R -, TNF-und IL-1β-Genen gefunden. Es scheint klar, dass rBST-Behandlungen eine Hochregulierung dieser Gene auslösen und ihre Verwendung in zukünftigen Überwachungspanels eine vielversprechende Option für die Routinekontrolle in der Molkerei ist.,

Wie bei einer Routinekontrolle zur Erkennung der unerlaubten Verwendung von rBST mit diesem Genpanel würden keine Informationen darüber vorliegen, wann Kühe behandelt wurden (mit anderen Worten, es handelt sich um einen Blindtest), idealerweise sollte jeder Tag während der Laktation abgetastet/kontrolliert werden. Aus praktischer Sicht klingt dieser Vorschlag jedoch etwas unrealistisch. Was es vorgeschlagen wird, ist eine zufällige Sammlung von Milch einmal pro Woche, abwechselnd Wochentage., Da Somatotropin während der gesamten Laktation regelmäßig verabreicht wird (ab 80-100 Tagen nach der Geburt, zweiwöchentlich), sollten bei allen laktierenden Kühen des Betriebs mit einem guten Probenahmeplan irgendwann rBST im Betrieb nachgewiesen werden. Die transkriptomischen Daten aus den gesammelten Proben müssen mit einem transkriptomischen Datensatz aus einer Kontrollpopulation verglichen werden. Diejenigen Proben, die höhere Werte von Genen vorstellten, die in diesem Papier vorgeschlagen wurden, sollten als verdächtig angesehen werden. Der zweite Schritt sollte die Untersuchung der besonderen Situation jeder „positiven“ Kuh (Mastitis, Schwangerschaft usw.) sein.,), und, falls erforderlich, weiterhin bestätigende Analyse. Es ist wichtig, auch die hohen Durchsatzkapazitäten dieses Echtzeit-PCR-Ansatzes hervorzuheben, um den Probenahmeplan durchführbar zu machen.