Ergebnisse und Diskussion
Die Arabidopsis cDNA-Bibliothek wurde unter Verwendung des 35S-markierten CaM-Binding-Screening-Ansatzes wie beschrieben gescreent (24). Einer der positiven Klone zeigte eine identische Nukleotidsequenz zu AtCat3 in der Datenbank (GenBank-Nr. U43147). Um zu beweisen, dass AtCat3 ein CaM-bindendes Protein codierte, wurde der vollständige Codierungsbereich von AtCat3 in den pET14b-Expressionsvektor subkloniert. Das rekombinante AtCat3 wurde durch Isopropyl β-d-Thiogalactosid (IPTG) induziert (Abb., 1A) und wurde durch CaM-Affinitätschromatographie bis nahe Homogenität gereinigt. Insgesamt bakterielle Extrakt wurde verwendet für die CaM-Bindung assay, und es wurde gezeigt, dass 35S-labeled CaM bindet an die AtCat3 protein in Anwesenheit von Ca2+ (Abb. 1A). Nach Zugabe von EGTA wurde keine Nockenbindung beobachtet. Darüber hinaus banden 35S-markierte Nocken nicht an AtCat3, wenn CaCl2 durch andere zweiwertige Kationen wie MgCl2 oder MnCl2 ersetzt wurde (Abb. 1A), was darauf hindeutet, dass die Nockenbindung an AtCat3 Ca2+ – abhängig ist.
die CaM-Bindung an AtCat3., (A) Bakterielle Gesamtproteine vom Wildtyp AtCat3 wurden einer SDS/PAGE-und Coomassie-Färbung unterzogen oder auf eine Nitrozellulosemembran übertragen. Die Membran wurde mit 35S-markiertem 50 nM CaM in einem Puffer inkubiert, der 0,4 mM EGTA, 0,2 mM CaCl2, 0,2 mM MgCl2 oder 0,2 mM MnCl2 enthielt. (Links) Coomassie färbung gel zeigt die induktion der AtCat3 durch IPTG. (Rechts) CaM-Bindungstest, der zeigt, dass CaM in Gegenwart von Kalzium spezifisch an AtCat3 bindet. (B) Abbildung des CaM-Bindungsbereichs in AtCat3., (Links) Coomassie-Färbungsgel, das die Gesamtproteine von Wildtyp-oder Deletionsmutanten von AtCat3 nach IPTG-Induktion zeigt. (Rechts) CaM-Bindungstest, der zeigt, dass Calcium / CaM an Wildtyp und mutierte 1-451 bindet, nicht jedoch an mutierte 1-414. (C) Gel-Mobility-Shift-Assay mit CAM-Bindung an das synthetische Peptid (Aminosäuren 415-451 in AtCat3) (links) in Gegenwart von 0,2 mm CaCl2 und (rechts) in Gegenwart von 0,4 mm EGTA.
Um den CaM-Bindungsbereich in AtCat3 zu identifizieren, wurden zwei C-Terminal-Deletionsmutanten für 35S-CaM-Bindungsassays verwendet. In Gegenwart von 0.,2 mM Ca2+, CaM bindet an den Wildtyp und die Mutante 1-451, während CaM nicht an die Mutante 1-414 bindet (Abb. 1B), was darauf hindeutet, dass der CaM-Bindungsbereich für AtCat3 auf Aminosäuren 415-451 beschränkt ist. Um die CAM-Bindung an AtCat3 weiter zu bestätigen, wurde ein synthetisches Peptid entsprechend den Aminosäuren 415-451 von AtCat3 mit CaM inkubiert. Die Bildung der Peptid-CaM-komplexe wurde anhand von nondenaturing SEITE. Das 36-mer-Peptid ist in der Lage, einen stabilen Komplex mit CaM in Gegenwart von Ca2+ zu bilden (Abb. 1C). In Abwesenheit von Peptid wurde ein einzelnes CaM-Band beobachtet., Als die Peptidkonzentration zunahm, erschien eine andere Band mit geringer Mobilität, die den Peptid-CaM-Komplex darstellte. Wenn das molare Verhältnis zwischen Peptid und CaM 1:1 betrug, wurde nur die Peptid-CaM-Komplex-Band nachgewiesen, was darauf hinweist, dass sich nur eine CaM-Bindungsstelle im Peptid befindet. In Gegenwart von EGTA wurde kein Peptid-CaM-Komplex gebildet (Abb. 1C). Diese Ergebnisse zeigen, dass CaM spezifisch calciumabhängig an das AtCat3 bindet.
Katalase existiert in fast allen aeroben Organismen. Bei Tieren gibt es nur eine Katalase-Isoform, die von einem einzelnen Gen kodiert wird., Im Gegensatz dazu ist Katalase in Pflanzen als multiple Isoformen vorhanden, die von einer kleinen Genfamilie kodiert werden (6, 26). Zumindest gilt dies für Monokots wie Mais und Dikots wie Tabak, Arabidopsis und Kürbis, in denen Katalase gut charakterisiert ist. Interessanterweise hat jeder von ihnen drei Isoformen, die von drei Genen kodiert werden. Um festzustellen, ob alle Katalasen die CaM-bindenden Regionen aufweisen, wurden die Aminosäuresequenzen von 37 Katalasen aus Bakterien, Tieren und Pflanzen mit dem Pileup-Programm im GCG10-Paket verglichen., Der Aminosäuresequenzvergleich ergab eine sehr hohe Homologie im N-terminalen 384 aa (etwa 60% Ähnlichkeit und 50% Identität). In dem C-Terminal 108 aa, in dem sich der CaM-Bindungsbereich befindet, bestand jedoch eine sehr geringe Ähnlichkeit zwischen AtCat3 und anderen Nicht-Katalasen (etwa 21% Homologie und 14% Identität). Dennoch zeigten alle Pflanzenkatalasen in diesem Teil eine hohe Homologie (etwa 78% Homologie und 70% Identität), insbesondere in der Region, die dem CaM-Bindungsbereich in AtCat3 entsprach. Abb. 2 zeigt den C-Terminal 108-aa Sequenzvergleich von 13 repräsentativen Katalasen., Obwohl die Aminosäuresequenzen in den charakterisierten CaM-bindenden Proteinen im CaM-bindenden Bereich nicht konserviert sind, weisen die meisten von ihnen ein sekundäres Strukturmerkmal auf, die basische amphiphile α-Helix (27), wie das Auxin-regulierte Protein ZmSAUR1 (24) und die pflanzliche chimäre Ca2+/CaM-Proteinkinase (28). Beachten Sie, dass es in CaM-bindenden Regionen häufig negativ geladene Aminosäuren gibt, die Nettoladung jedoch positiv ist (16). Basierend auf der helikalen Radprojektion unter Verwendung des GCG-Programms wurde festgestellt, dass die Aminosäuren 438-451 in AtCat3 in der Lage sind, eine basische amphiphile α-Helix zu bilden., Es ist klar, dass eine Seite des helikalen Rades hydrophob und die andere Seite hydrophil mit netto positiven Ladungen ist. Die Analyse der Aminosäuresequenzen, die der CaM-bindenden Region von AtCat3 entsprechen, sagte die Existenz einer basischen amphiphilen α-Helix in einigen anderen Pflanzenkatalasen voraus. Interessanterweise gibt es unter drei Katalase-Isoformen in Mais, Tabak, Arabidopsis und Kürbis mindestens eine Isoform mit der amphiphilen α-helikalen Struktur in jeder Spezies, z,, tobacco1 (Aminosäuren 431-444), maize3 (Aminosäuren 442-455) und pumpkin1 (Aminosäuren 438-451) sowie Arabidopsis AtCat1 (Aminosäuren 438-451). Ob dies für alle Pflanzenarten gilt, ist aufgrund der begrenzten Katalasesequenzen für andere Pflanzenarten in GenBank nicht klar. Basierend auf den Kristallstrukturdaten von Bakterien-und Säugetierkatalasen sind α-Helices die typischen Strukturen im C-terminalen Teil dieser Katalasen (29), aber in diesem Teil existiert keine grundlegende amphiphile α-helikale Struktur gemäß helikaler Radprojektion.,
Um zu testen, ob CaM an gereinigte Katalase aus Planta bindet, wurde Tabakkatalase aus den Blättern auf der Basis von Durner und Klessig gereinigt (10). Eine CaM-Sepharose-Säule wurde als letzter Schritt im Reinigungsprozess verwendet. Die Zusammenfassung der Reinigungsschritte der Katalase unter Verwendung von 1.000 g Tabakblättern ist in Tabelle 1 dargestellt. Tabakkatalase wurde nahezu homogen gereinigt, wie durch SDS/PAGE und Silberfärbung beurteilt (Abb. 3, Spur 1). Die Katalase-Identität wurde durch Western Blotting mit einem mAb gegen die Tabakkatalase bestätigt (Abb. 3, Spur 3)., Die CAM-Bindung an gereinigte Tabakkatalase wurde durch die folgenden Ansätze demonstriert. (i) Eine CaM-Sepharose-Säule wurde zur Reinigung der Tabakkatalase verwendet. Die Rückgewinnungsrate für diesen Schritt betrug 81% (Tabelle 1), was darauf hindeutet, dass der größte Teil der Katalase aus Tabakblättern ein CaM-bindendes Protein ist. (ii) 35S-markierter CaM wurde verwendet, um die Bindung an die gereinigte Katalase in Gegenwart von 0,2 mM CaCl2 zu testen (Abb. 3, Spur 5). Rekombinantes AtCat3 wurde als Kontrolle verwendet (Abb. 3, Fahrspuren 2, 4 und 6). Neben der 0.,4 mM EGTA beseitigte die CaM-Bindung, was darauf hindeutet, dass CaM auf Ca2+ – abhängige Weise an die Pflanzenkatalase bindet. CaM-bindende Assays wurden auch durchgeführt, um festzustellen, ob es an Pilz -, Rinder-oder Humankatalyse bindet. Die Ergebnisse zeigten, dass keines dieser nonplant catalases zeigte keine CaM-Bindung (Daten nicht gezeigt), die in Absprache mit der Aminosäure-Sequenz-Vergleiche (Abb. 2).,
- Inline anzeigen
- Popup anzeigen
Reinigung von Katalase aus Tabakblättern
CaM bindet an Pflanzenkatalyse. Spur 1, Silberfärbung, die die Reinheit der Katalase aus Tabakblättern zeigt. Lane 3, Western Blot zeigt, dass monoklonale Tabakkatalase-Antikörper gereinigte Katalase nachweisen können. Lane 5, CaM-Binding Assay, der zeigt, dass 35S-CaM an gereinigte Katalase bindet. Zwei-Mikrogramm-rekombinante AtCat3 wurde als Kontrolle in jedem Experiment geladen (Spuren 2, 4 und 6).,
Die CaM-Bindungsstelle oder eng nebeneinander liegende Regionen in anderen charakterisierten CaM-bindenden Proteinen fungieren häufig als autoinhibitorische oder Pseudosubstrate-Domänen. Diese Region hält die Zielproteine in Abwesenheit eines Ca2+-Signals in einem inaktiven Zustand, wie beispielsweise in der chimären Ca2+/CaM-abhängigen Proteinkinase (30) und Glutamatdecarboxylase (31). Um die Bedeutung der CAM-Bindung an Pflanzenkatalasen zu untersuchen, wurden katalytische Aktivitäten des rekombinanten AtCat3 und der gereinigten Tabakkatalase in Gegenwart und Abwesenheit von CaCl2 und CaM gemessen., Ähnliche Experimente wurden auch unter Verwendung anderer nichtplantärer Katalasen durchgeführt. Die E. coli-exprimierte rekombinante AtCat3 zeigte keine Aktivität. Ähnliche Ergebnisse wurden in einem anderen Labor erhalten (Zhixiang Chen, persönliche Kommunikation). Dies kann auf das Versagen zurückzuführen sein, die richtige Struktur für rekombinante Katalase zu bilden, da die aktive Katalase ein Tetramer ist, der aus vier identischen oder ähnlichen Untereinheiten besteht (6, 10, 26). Im Gegensatz dazu zeigte die gereinigte Tabakkatalase eine signifikante Ca2+/CaM-abhängige Aktivitätsänderung während der Reinigungsschritte (Tabelle 1)., Die stimulierenden Wirkungen von Ca2+ / CaM sind in jedem Schritt etwa 2,2-fach, mit Ausnahme der Probe, die nach der CaM-Sepharose-Chromatographie erhalten wurde. Es zeigte eine höhere Stimulation der Katalaseaktivität (2,5-fach), möglicherweise aufgrund der Entfernung der nicht-Ca2+ / CaM-bindenden Katalasefraktion (Tabelle 1). Die nicht-Ca2+ / CaM-bindende Katalasefraktion hatte eine spezifische Aktivität von 59,6 Einheiten (basale Aktivität). Ca2+ / CaM stimulierte jedoch nicht die Aktivität dieser Fraktion von Katalase (Daten nicht gezeigt)., Diese Ergebnisse zeigen, dass Ca2+ / CaM in der Lage ist, die Tabakkatalase in der Fraktion zu aktivieren, die nach der CaM-Sepharose-Chromatographie erhalten wurde, was den CaM-Bindungsergebnissen entspricht. Um die Auswirkungen von Ca2+/CaM auf die Aktivität von Katalasen aus verschiedenen Quellen zu vergleichen, wurde die relative Aktivität verwendet, da es signifikante Unterschiede in der spezifischen Aktivität von Katalasen verschiedener Arten gibt. Zum Beispiel hat A. niger Katalase die spezifische Aktivität von 5,7 Einheiten; Rinderleberkatalase, 51,9 Einheiten; menschliche Erythrozyten, 39,5 Einheiten; Tabakkatalase, 63.,1 Einheiten (in Abwesenheit von Ca2+/CaM). Abb. 4A zeigt, dass CaCl2 allein oder CaM allein keine stimulierende Wirkung auf die Tabakkatalaseaktivität hatte (etwa 40% der maximalen Aktivität). Es wurde kein Unterschied in der katalytischen Aktivität bei Pilz -, Rinder-oder menschlichen Katalasen in Gegenwart oder Abwesenheit von Ca2+, CaM und Ca2+/CaM beobachtet (Abb. 4A). Durch Ersetzen von CaCl2 durch MgCl2 gab es keine signifikante Veränderung der Tabakkatalyseaktivität in Gegenwart oder Abwesenheit von CaM (Daten nicht gezeigt)., Um die Wirkung von Ca2+/CaM auf die Pflanzenkatalaseaktivität weiter zu dokumentieren, wurden 10 µM des Peptids entsprechend der AtCat3 CaM-Bindungsregion (415-451) zu jeder Reaktionsmischung zugegeben. Nichtplantäre Katalasen wurden durch die Zugabe des Peptids nicht beeinflusst. Die stimulierende Wirkung von Ca2+/CaM auf die Tabakkatalaseaktivität wurde jedoch durch Zugabe des Peptids abgeschafft (Abb. 4A). Darüber hinaus hing die hemmende Wirkung des Peptids auf die Tabakkatalaseaktivität von der Konzentration des Peptids ab (Abb. 4B)., Die Katalaseaktivität wurde um etwa 58% gehemmt, was der basalen Aktivität der Katalase nahe kommt. Das Peptid hatte jedoch bei allen getesteten Konzentrationen keinen Einfluss auf die Rinderkatalaseaktivität (Abb. 4A). Diese Ergebnisse legen nahe, dass Ca2+ / CaM eine stimulierende Wirkung auf die gereinigte Pflanzenkatalase hat, aber keine Wirkung auf die nichtplantären Katalasen hat.
Calcium / CaM reguliert die katalytische Aktivität der Pflanzenkatalyse. Die Aktivität der Katalase wurde durch Überwachung des H2O2-Zerfalls bei 240 nm vor und nach Zugabe von Katalase in Gegenwart und Abwesenheit von Ca2+ und/oder CaM gemessen., Die Aktivität wurde als Prozentsatz der maximalen Aktivität für jede Katalase ausgedrückt. Daten sind der Mittelwert ± SE aus vier separaten Experimenten. (A) CaM aktiviert die Tabakkatalase in Gegenwart von Kalzium. Das Peptid, das der CaM-bindenden Region in AtCat3 (Aminosäuren 415-451) entspricht, hemmt die Tabakkatalaseaktivität. (B) Kinetik der Hemmung der Tabakkatalaseaktivität durch Peptid (Aminosäuren 415-451). ● , Rinderleberkatalase;○, Tabakkatalase.,
Es ist bekannt, dass Katalase ein vorherrschendes peroxisomales Enzym ist, aber es existiert auch in den Mitochondrien und im Zytoplasma (32). Beispielsweise ist Mais Cat3, bei dem es sich um eine CaM-bindende Katalase auf Basis eines Aminosäuresequenz-Vergleichs handeln könnte, ein mitochondriales Protein (33). Unsere Ergebnisse (Abb. 1-4) zeigen, dass CaM an Pflanzenkatalase bindet und seine Aktivität reguliert. Um das Vorhandensein dieser regulatorischen Aktivität in vivo nachzuweisen, untersuchten wir, ob CaM in den Peroxisomen von Pflanzen mit Katalase koexistiert., Organellen aus etiolated Kürbis cotyledon Extrakte wurden durch Saccharose Dichte Zentrifugation getrennt. Um die Kontamination von zytosolischen Proteinen, die in der Lösung vorhanden oder lediglich mit der peroxisomalen Membran assoziiert sein könnten, zu entfernen, wurden die isolierten Peroxisomen mit Proteinase K behandelt. Auf diese Weise wurden die peroxisomalen Proteine, die durch die peroxisomale Membran vor Protease geschützt waren, nicht verdaut (34, 35). Die Identität der peroxisomalen Fraktionen wurde durch Messung der Katalaseaktivität nachgewiesen (35)., CaM ist in allen Königreichen (13-16) sehr konserviert, daher haben wir eine westliche Analyse mit einem anti-humanen CaM-Antikörper durchgeführt. Als Kontrolle wurde die rekombinante Kartoffel CaM PCM6 verwendet (Abb. 5, Spur 3). Interessanterweise war in den peroxisomalen Fraktionen eine Bande in einer PCM6-ähnlichen Größe vorhanden, die Intensität war jedoch im Vergleich zum zytosolischen CaM erheblich geringer (Abb. 5). Diese Ergebnisse zeigen, dass CaM und Katalase in den Peroxisomen kolokalisiert sind. CaM ist ein kleines saures Protein, das hauptsächlich im Zytoplasma exprimiert wird., Es wurde jedoch gezeigt, dass CaM in Pflanzen in mehreren Organellen wie dem Kern und den Chloroplasten (36, 37) und der extrazellulären Matrix (38) vorhanden ist. Auch CaM-regulierte Proteine existieren in extrazellulären Matrix, Kern und Chloroplasten (38-40). Wie CaM die Membran überquert, ist nicht klar. Neuere Studien zeigen, dass posttranslationale Modifikationen eine Rolle bei der Translokation einiger CaM-Isoformen spielen. Zum Beispiel ist ein Petunien-CaM-ähnliches Protein, CaM53, mit Plasmamembran assoziiert, wenn das Protein pränyliert wird. Wenn die Prenylierung gehemmt wird, findet sich CaM53 vorwiegend im Kern (41).,
Die Existenz von CaM in Peroxisomen. Zwanzig Mikrogramm Gesamtproteine aus dem Peroxisom und Cytosol wurden in 15% SDS/PAGE getrennt und einer Analyse unterzogen. CaM wurde durch einen anti-bovinen CaM-Antikörper nachgewiesen. Als Kontrolle wurden zwei Mikrogramm Kartoffelpuffer verwendet. Spur 1, Peroxisomenfraktion; Spur 2, Cytosolfraktion; Spur 3, PCM6.
Unseres Wissens gibt es keinen Bericht über die Calciumkonzentration in den Peroxisomen., Basierend auf einem kürzlich modifizierten Modell der Peroxisomenbiogenese stammt das Peroxisom mittels präperoxisomaler Vesikel aus dem endoplasmatischen Retikulum (ER) (42). Es ist bekannt, dass der ER einer der intrazellulären Calciumpools ist. Somit könnte die Calciumkonzentration in Peroxisomen so hoch sein wie in der ER. Die Messung der peroxisomalen Calciumkonzentration und die Überwachung eines Zusammenhangs zwischen der Änderung der Calciumkonzentration im Zytoplasma und dem Peroxisom sollten zu unserem Verständnis beitragen, wie die peroxisomale Katalase durch Ca2+/CaM reguliert wird., Beispielsweise könnte die freie Calciumkonzentration in den transgenen Pflanzen mit dem rekonstituierten Aequorin mit einem Peroxisom-Targeting-Signal gemessen werden. Aequorin ist ein calciumempfindliches Lumineszenzprotein, dessen Lumineszenz direkt die Calciumveränderung meldet (43). Da Peroxisom eine Hauptorganelle ist, die das toxische ROS, hauptsächlich H2O2, entfernt, ist es vernünftig zu spekulieren, dass die peroxisomale Katalaseaktivität die ganze Zeit hoch bleibt, um H2O2 in situ schnell abzubauen. Schwankungen des zytosolischen Calciums könnten jedoch einen großen Einfluss auf die zytosolische Katalaseaktivität haben., Es ist wichtig zu betonen, dass nicht alle Katalasen CaM-bindende Proteine sind. Daher sind weitere Untersuchungen erforderlich, um die Bedeutung von Ca2+/CaM bei der Kontrolle der Katalaseaktivität in verschiedenen Organellen zu untersuchen.
Biotische und abiotische Belastungen lösen einen Ca2+ – Zustrom aus, und das erhöhte cytosolische Ca2+ stimuliert die Produktion von H2O2, das als Bote in die umgebenden Zellen diffundiert und die physiologische Reaktion induziert (19, 20). Unsere Ergebnisse legen nahe, dass ein erhöhter cytosolischer Ca2+ H2O2-Spiegel durch Ca2+/CaM-vermittelte Stimulation der Katalaseaktivität senken kann (Abb. 4)., Wir schlagen vor, dass erhöhtes cytosolisches Ca2+ eine doppelte Rolle bei der Regulierung der H2O2-Homöostase spielt (Abb. 6): (i) positive Regulation erzeugt H2O2 durch direkte Aktivierung der NADPH-Oxidase, die eine Affinität zu Ca2+ (22) aufweist und indirekt mehr NADPH durch Ca2+/CaM-regulierte NAD-Kinase produziert (23); und (ii) negative Regulation reduziert H2O2 durch Stimulierung der Katalaseaktivität durch Ca2+/CaM-Modulation (Abb. 4)., Signalinduzierte Änderungen der Ca2+ – Transienten können sich in der Frequenz, Dauer, Amplitude und räumlichen Lokalisierung von Schwingungen sowie in der Art der räumlichen Ausbreitung unterscheiden, was zu differentiellen Effekten auf die Calciumzielproteine führt (12, 44).
Modell mit Ca2+ – ausgelösten Änderungen, die zur positiven und negativen Regulierung des H2O2-Spiegels in Pflanzen führen. Für eine positive Regulation lösen extrazelluläre Signale einen Zustrom von Ca2+ aus, was die Erzeugung von H2O2 erhöht., Dies kann durch Aktivierung der NADPH-Oxidase, die eine Affinität zu Ca2+ aufweist, und Erhöhung der Produktion von NADPH mittels CaM-regulierter NAD-Kinase erfolgen. Zur negativen Regulierung bindet Ca2+ an CaM, und der Ca2+/CaM-Komplex stimuliert die katalytische Aktivität der Katalase, was zum schnellen Abbau von H2O2 führt. Der Anstieg von H2O2 kann den Ca2+ – Zustrom erhöhen, indem der Calciumkanal aktiviert wird.
