výsledky
neošetřené vzorky. Zejména pozorujeme, že i v nestabilních vzorcích jsou rozdíly mezi kapkami vody a oleje (obr. 1 B A C) nebo mezi různými složkami buňky (obr. 1D) generovat dostatečný kontrast k jejich odlišení. V buňkách mají materiály vyšší-Z, jako jsou soli, fosfor a železo, které mohou být koncentrovány v různých oblastech, tendenci zlepšovat kontrast. Obr., 1D ukazuje neošetřenou buňku vaječníku čínského křečka (CHO) v normálním kultivačním médiu při pokojové teplotě. Obrys buňky a jádro s vnitřní strukturou jsou jasně viditelné, stejně jako řada tmavých sférických částic v cytoplazmě. Identifikace těchto částic jako lipidových kapiček je popsána níže.
barvení těžkých kovů. Limity rozlišení a kontrastu při pozorování materiálů s nízkým Z naznačují, že podstatných výhod lze dosáhnout barvením buněk značkami s vysokým Z, jako jsou elektronově husté skvrny nebo nanočásticové zlaté štítky., Ve skutečnosti jsme schopni detekovat zlaté korálky ve vodě až do průměru 10 nm pomocí ultratenkých membrán (data nejsou zobrazena).
diferenciální barvení organel uvnitř buněk pomocí materiálů electrondense je standardem v technice EM, i když se obvykle nepoužívá pro SEM. Obr. 2 ukazuje bohatou škálu struktur uvnitř kultivované buňky, které byly pěstovány přímo na oddíl, membrány a následně fixovány a barveny uranyl acetát (8). Intracelulární organely jsou jasně viditelné, včetně vnitřních detailů mitochondrií(obr. 2C), aktinová stresová vlákna (obr., 2D) a komplexní tubulární a cytoskeletální struktury (obr. 2 A A B). Vyšší energie paprsku na obr. 2C sondy vnitřní struktury, zatímco při nižší energii (obr. 2D), povrch v blízkosti membrány je vizualizován. K získání trojrozměrných informací lze tedy použít různé energie.
zobrazování obarvených buněk. Hvězdičky označují jádra a tenké šipky označují mitochondrie. (A) HeLa buňky pěstované na membráně v normální růst střední, pak fixovány paraformaldehydem a obarveny s uranyl acetát (zobrazen ve 12 kV)., (B) Zvětšení vyznačeném obdélníku je uvedeno v A. (C) CHO buňky fixovány glutaraldehyd a paraformaldehyd, barveny uranyl acetát, a udržována ve vodě (zobrazen na 30 kV). Tlustá šipka označuje mitochondrion, který obklopuje lipidovou kapičku. (Vložka) vyšší zvětšení zobrazující mitochondrie (tenké šipky). D) aktinová vlákna v obarvených CHO buňkách. Léčba a zobrazování jsou popsány pro a.
nanočástice zlaté markery. Vysoké rozlišení a specifičnost detekce lze dosáhnout vazbou protilátek nebo jiných ligandů., Stejně jako u jiných metod EM se označování provádí nejpohodlněji pomocí nanočástic zlata. V kontrastu s transmisní EM (TEM), která vzorky pouze velmi tenká a často svévolné oddíly, mokré SEM umožňuje rychlé přepínání mezi místní a globální pohled na značení celé buňky. Obr. 3 A A B ukazují, jak 40-nm nanočástice zlato značené monoklonální antiepidermální protilátky růstového faktoru byly použity pro označení receptorů epidermálního růstového faktoru na neporušených rakovinných buňkách A431., Fixace je často užitečná a pohodlná i ve vlhkém SEM a může usnadnit označování i přenos do mikroskopu. Zde prezentované buňky jsou také obarveny uranylacetátem, což umožňuje sladění značených receptorů s obecnou strukturou buněk. Vysoký kontrast a jednotná velikost nanočástic umožňují jednoznačnou identifikaci a lokalizaci. Znalost přesné lokalizace molekul jednoho receptoru otevírá možnost měření událostí, jako je dimerizace receptoru indukovaná epidermálním růstovým faktorem., Barvení buněk není nutné pro označování a zahrnuli jsme obraz nezatížených, označených buněk(obr. 7, který je publikován jako podpůrné informace na webových stránkách PNAS). Také je zobrazen obrázek prokazující, že je možné označit vnitřní části buňky (obr. 8, který je publikován jako podpůrné informace na webových stránkách PNAS), v tomto případě označení mitochondrií zlatými korálky. Označování aktinových vláken uvnitř buněk bylo také dosaženo použitím částic zlata subnanometru, následovaným vylepšením stříbra (data nejsou zobrazena).
zobrazování nanočástic zlatých markerů na buňkách. Šipky označují nanočástice zlata. (A) Epidermální růstový faktor receptory immunolabeled s 40-nm zlaté nanočástice na A431 buňky a kontrastním s uranyl acetát (zobrazen na 30 kV). (B) Zvětšení označený obdélník je znázorněno v. E. (C) Domnělé gastrin receptory na H. pylori bakterie, po inkubaci s komplexně biotinylated gastrin na streptavidin-coated 20-nm zlaté částice, následuje glutaraldehyd a sedimentace na poly-(l-lysin)-potažené membrány (zobrazen na 20 kV).,
příklad označení zlata na bakteriích je uveden na obr. 3C . Zde je domnělý gastrinový receptor Helicobacter pylori (9)detekován inkubací s komplexy biotinylovaného gastrinu a 20 nm nanočástic zlata potažených streptavidinem. Podávání biotinylovaného gastrinu před podáním zlata potaženého streptavidinem nepřineslo téměř žádné připojení nanočástic k bakterii. Tento výsledek byl získán nezávisle na čase mezi těmito dvěma kroky, což naznačuje, že příjem gastrinu do H.pylori je téměř okamžitý., Skutečnost, že komplexovaný gastrin nevstoupil do buněk, ukazuje na možnost definování limitů velikosti částic, které mohou být bakteriemi internalizovány.
porovnání zobrazovacích technik (Trypanosoma brucei). Je užitečné porovnat tuto technologii se stávajícími zobrazovacími technikami pomocí jednomodelového systému. Taková studie je podrobně popsána na obr. 4, pomocí parazita T. brucei procyklická forma, která se šíří v midgutu mouchy tsetse. První tři obrázky zobrazují existující režimy zobrazování: optická fluorescenční mikroskopie (obr., 4A), diferenciální interferenční kontrastní mikroskopie (obr. 4B ) a TEM (obr. 4C ). Síla existujících technik je zřejmá: lokalizované značení ve fluorescenci a podrobné sekce V TEM. Neošetřená optická (obr. 4B) a mokré SEM (obr. 4D) obrázky vymezují hranice buňky, ale mají nízký kontrast a postrádají detaily. Oba zdůrazňují jádro, ale jiné organely, které se objevují v diferenciálním interferenčním kontrastním obrazu, nejsou jasně identifikovány, zatímco obraz wet-SEM přináší výhodu lipidových kapiček. Oxidem osmičelým barvení (Obr., 4E ) není v tomto systému tak užitečný, zdůrazňuje většinou lipidové kapičky a některé neidentifikované vnitřní organely. Nejsilnější zobrazování je vidět na obr. 4F, pro které bylo použito barvení uranylacetátu. Výhoda intaktního zobrazování, s nímž lze vidět celou buňku (spolu s jemnými vnitřními strukturami, které lze podrobně pozorovat), je zřejmá, zejména ve srovnání s TEM zobrazováním (obr. 4C ). Konečně, mokré-SEM zobrazení celých buněk-specifické značení protilátky proti hlavní glycosylphosphatidylinositol-ukotvené povrchová úprava bílkovin EP procyclin (10) je znázorněno na Obr., 4 G A H . Je zajímavé, že EP procyclin je známo, že rovnoměrně pokrývá celou buňku, ale pozorovaný signál je seskupen. Jsme připisují tendence hlubších lipidové rafty do clusteru pod vlivem protilátek, proces, který fixaci ve formaldehydu je schopen zabránit. Zlaté značky také osvětlit trojrozměrné konformace buňky způsobem, který je připomínající to, co standardní SEM může obraz (vynikající, zástupce SEM obrázek z T. brucei lze nalézt na http://tryps.rockefeller.edu/crosslab_intro.html).
multimodální zobrazování T. brucei., Typická délka buňky je 20 µm na délku a 3 µm na šířku. A) konfokální fluorescenční mikroskopie. Byly použity Anti-EP procyklinové protilátky (Cedarline) a vazba byla detekována Anti-myší spojenou s fluoresceinovým isothiokyanátem (zeleným). Barvení jádra a kinetoplastu bylo s propidiumjodidem (červeným). B) optické (rozdílové interference kontrast) zobrazování. C) TEM části buňky, následované barvením uranylacetátu, odhalující vnitřní organely. D) mokré zobrazování celých, hydratovaných, nezatížených buněk. (E), Jak je popsáno pro D pomocí oxidem osmičelým barvení., F) jak je popsáno pro D za použití barvení uranylacetátem. G) nanočásticové zlaté markery spojené s protilátkami proti myším, ukazující umístění povrchového proteinu EP procyclin a umožňující současně trojrozměrný pohled. (H) vyšší zvětšení střední části buňky zobrazené v G, objasnění oblasti trojrozměrné helicity v buňce.
je Zřejmé, že TEM bude mít lepší rozlišení, obecně, než mokré SEM, ale obrazy, které prezentoval na příkladu T. brucei pro srovnání jsou „typické“ obrazy, získaných ve stejné laboratoři., Protože mokré SEM je jiný v jeho užitečnost, než TEM a optické mikroskopie, v T. brucei může být viděn jako důležitý doplňující schopnosti, a dá se očekávat, že celý obrázek bude dána kombinací optické, TEM, a mokrý-SEM techniku.
tkáňové řezy. Mokrý SEM může být použit pro silné vzorky, jako jsou fragmenty tkáně, jednoduše namontováním vzorku proti membráně. Omezený odběr vzorků z hloubky Gsse umožňuje zobrazování „virtuální oddíl,“ sahající od povrchu do definované hloubky až několika mikrometrů, bez nutnosti pro tenké krájení.,
Obr. 5 A A B ukazuje přímou vizualizaci neošetřených tkání z myši. Obr. 5A je malý zvětšovací obraz srdeční tkáně. Organizace svalových buněk je zřejmá. Přiblížení na jednu buňku (obr. 5B) poskytuje živý pohled na jádro a intracelulární organely, případně mitochondrie a jejich disperzi v buňce. Jak je uvedeno výše pro Kultivované buňky, barvení tkání je výhodné, ale Není nezbytné a může zvýšit vizualizaci mnoha funkcí. Obr. 5 C A D ukazuje oblast renální kůry krysy., Barvení (ferricyanid draselný) zdůrazňuje celkovou organizaci a buněčné kontakty v epitelu renálních tubulů. Pozor, úprava, barvení a zobrazovací podmínky mohou odhalit různé a doplňující informace, jako jsou tkáně architektury; např. tkání barveny uranyl acetát výnos čistý obraz extracelulární matrix (data nejsou zobrazena).
zobrazování tkání. (A) myší srdce, neošetřené, zobrazené přímo v držáku vzorku při 30 kV. B) vyšší zvětšení obdélníku znázorněného na a., (C) Krysa ledvin byl členitý, střih, a fixovány formalínem za 24 h. Tkáň pak byla potřísněné s 0,1% uranyl acetátu po dobu 10 min. C A D ukazují epiteliální buňky uvnitř vnitřního povrchu tubulů medulárních paprsků. Mřížka podporující membránu je viditelná na tomto obrázku. (D) zvětšení pole zobrazeného v C.
simultánní sběr fotonu (CL). Detekce BSE ve vlhkém SEM může být doplněna současným sběrem fotonů., Skenovací elektronový paprsek vzrušuje molekuly ve vzorku, které pak mohou vyzařovat světlo na charakteristických vlnových délkách (CL). Intenzita světla se pak používá k odvození obrazu distribuce scintilačních molekul, buď endogenních k buňce, nebo štítků, které mohou být zavedeny extra. Tento obraz je získán současně se zobrazením BSE v rozlišení omezeném interakcemi elektronové hmoty a nikoli světelnou difrakcí (6). Do tekutiny pod vzorkem jsme vložili světelný průvodce, který vede vyzařované světlo k fotomultiplikátoru., Toto nastavení dosahuje dobrého spojení a efektivního sběru fotonů excitovaných elektronovým paprskem, aniž by byla ohrožena účinnost souběžné detekce BSE.
Obr. 6 zobrazuje neošetřené CHO buňky, vizualizované současně BSE a fotony. Na Obr. 6A, hranice buněk jsou jasně vymezeny v režimu elektronového zobrazování a jádro (spolu s jeho nukleoly) je prominentní, stejně jako tmavé ≈1-µm skvrny kolem jádra. Ty se objevují v cytoplazmě všech eukaryotických buněk, které jsme zkoumali, a přestože se jejich počet liší, obvykle se rozptýlí kolem jádra., Na obrázku CL znázorněném na obr. 6B, buněčný obrys a jádro jsou jasně definovány, což svědčí o distribuci scintilačních molekul (podobně jako autofluorescence) v buňce. V tomto režimu jsou stejné skvrny charakterizovány vysokou emisí fotonů. Kombinace vysokého katodoluminiscenčního signálu a vysokého obsahu uhlíku je typická pro lipidové kapičky (11), které se podílejí na skladování energie buňky (12)., Nezávislý test přidání 200 µM kyselina olejová způsobil silnou zbraní těchto kapének v buňce (data nejsou zobrazena), v souladu s představou, že pozorované skvrny jsou lipidové kapičky.
simultánní zobrazování s fotony excitovanými zpětným rozptylem a elektronovým paprskem (CL). A)nepřizpůsobené CHO buňky, zobrazené pomocí BSEs, jak je popsáno na obr. 1D . B) vyzařovaný světelný obraz pořízený současně s obrazem uvedeným v písmenu A.,
Wet SEM má výhodu oproti standardním technikám SEM při ochraně lipidů, zejména u velkých agregátů, jako jsou lipidové kapičky. Odstranění potřeby sušení šetří lipidy z organických rozpouštědel, která je mohou rozpustit. I když osmium léčba bude zachovat některé lipidové dvojvrstvy, ve větších agregátů osmium rychle reaguje vytvořit externí kůru, která neumožňuje osmium, takže agregáty náchylné k následné organických rozpouštědel léčby., V kryogenních přípravcích je tendence procesu štěpení praskat podél hranic lipidů a vody také nebezpečím pro velké lipidové struktury.
zobrazování markerů s vysokým rozlišením je vysoce žádoucí schopností režimu detekce CL, který vyžaduje vývoj štítků pro specifické molekuly v buňkách. Na Obr. 9, který je zveřejněn jako podpůrné informace o PNAS webové stránky, jsme prokázat, že standardní fluorescenční korálky 0,2 µm v průměru emitují fotony intenzivně pod elektronového paprsku a může být zobrazen s rozlišením ≈100 nm (7)., Zobrazování menších korálků je omezeno nízkým jasem, což vede k vývoji specializovaných scintilačních korálků s malým průměrem . Protože mechanismus excitace scintilační je nejsilnější, když paprsek je přímo dopadající na korálek, očekáváme, že to může rozšířit rozlišení fluorescenční zobrazovací řádově mimo to je k dispozici s optické mikroskopie.
