Good Mood

resultaten

onbehandelde Monsters. Met name zien we dat, zelfs in niet-beklede monsters, de verschillen tussen water-en oliedruppels (Fig. 1 b en C) of tussen verschillende bestanddelen van de cel (Fig. 1D) genereer voldoende contrast om ze te onderscheiden. In cellen neigen hoger-Z materialen zoals zouten, fosfor, en ijzer, die in verschillende gebieden kunnen worden geconcentreerd, om het contrast te verbeteren. Fig., 1D toont een onbehandelde Chinese hamster ovarium (CHO) cel in normaal cultuurmedium bij kamertemperatuur. De omtrek van de cel en de kern met zijn interne structuur zijn duidelijk zichtbaar, evenals een reeks donkere, sferische deeltjes in het cytoplasma. De identificatie van deze deeltjes als lipidedruppeltjes wordt hieronder besproken.

kleuring van zware metalen. De grenzen van resolutie en contrast wanneer het observeren van laag-z-materialen stellen voor dat de wezenlijke voordelen door de cellen met hoog-z-tellers zoals elektron-dichte vlekken of nanoparticle gouden etiketten kunnen worden bereikt., Inderdaad, we zijn in staat om gouden kralen in water tot een diameter van 10 nm te detecteren door gebruik te maken van ultradunne membranen (gegevens niet getoond).

differentiële kleuring van organellen in cellen met behulp van electrondense materialen is een standaard in EM techniek, hoewel meestal niet toegepast voor SEM. Fig. 2 toont een rijke verscheidenheid aan structuren in gekweekte cellen die direct op het partitiemembraan werden gekweekt en vervolgens werden gefixeerd en gekleurd met uranylacetaat (8). Intracellulaire organellen zijn duidelijk zichtbaar, met inbegrip van interne details van mitochondriën (Fig. 2C ), actin spanningsvezels (Fig., 2D ), en complexe tubulaire en cytoskeletale structuren (Fig. 2 A en B). De hogere stralingsenergie in Fig. 2C sondes interne structuur, terwijl bij lagere energie (Fig. 2D), wordt de oppervlakte dicht bij het membraan gevisualiseerd. Zo kunnen verschillende energieën worden gebruikt om driedimensionale informatie te verkrijgen.

Nanoparticle Gold Markers. De hoge resolutie en de specificiteit van opsporing kunnen door band van antilichamen of andere ligands worden bereikt., Zoals met andere EM methodes, wordt de etikettering het meest gemakshalve gedaan door gouden nanoparticles te gebruiken. In tegenstelling tot transmission EM (tem), die slechts zeer dunne en vaak willekeurige secties samples, natte SEM maakt een snelle schakelen tussen de lokale en globale weergave van etikettering over de hele cel. Fig. 3 A en B tonen hoe 40 nm nanoparticle goud-geëtiketteerde monoclonal anti-epidermale de receptorantilichamen van de de groeifactor voor het etiketteren van de epidermale receptoren van de de groeifactor op intacte A431 kankercellen werden gebruikt., De fixatie is vaak nuttig en geschikt zelfs in natte SEM en kan de etikettering evenals de overdracht aan de microscoop vergemakkelijken. De hier gepresenteerde cellen worden ook bevlekt met uranylacetaat, die afstemming van de geëtiketteerde receptoren met de algemene structuur van de cellen toestaat. Het hoge contrast en de eenvormige grootte van nanoparticles staan ondubbelzinnige identificatie en lokalisatie toe. Het kennen van de nauwkeurige lokalisatie van enige receptormolecules opent de mogelijkheid om gebeurtenissen zoals epidermale de groeifactor-veroorzaakte receptordimerisatie te meten., Kleuring van de cellen is niet nodig voor de etikettering, en we hebben een afbeelding van Onbevlekte, geëtiketteerde cellen opgenomen (Fig. 7, die als ondersteunende informatie op de PNAS-website wordt gepubliceerd). Ook wordt een afbeelding getoond die aantoont dat het markeren van interne delen van de cel mogelijk is (Fig. 8, die wordt gepubliceerd als ondersteunende informatie op de PNAS-website), in dit geval, de markering van mitochondriën met gouden kralen. Het etiketteren van actin filamenten binnen van cellen is ook bereikt door subnanometergouddeeltjes te gebruiken, gevolgd door zilveren verhoging (getoonde gegevens niet).

in Fig. 3 quater . Hier wordt de vermeende gastrinereceptor van Helicobacter pylori (9) gedetecteerd door incubatie met complexen van gebiotinyleerde gastrine en streptavidin-gecoate 20 nm gouden nanodeeltjes. Het toedienen van de biotinylated gastrin vóór dat van het streptavidin-met een laag bedekt goud leverde bijna geen gehechtheid van nanoparticles aan de bacterie op. Dit resultaat werd onafhankelijk van de tijd tussen de twee stappen verkregen, wat erop wijst dat de opname van gastrine in H. pylori bijna onmiddellijk is., Het feit dat gecomplexeerde gastrine niet in de cellen kwam wijst op de mogelijkheid om de grenzen van de grootte van deeltjes te bepalen die door de bacteriën kunnen worden geïnternaliseerd.

vergelijking van beeldvormingstechnieken (Trypanosoma brucei). Het is nuttig om deze technologie te vergelijken met bestaande beeldvormingstechnieken met behulp van een enkel-modelsysteem. Een dergelijke studie is gedetailleerd in Fig. 4, met behulp van de parasiet T. brucei procyclische vorm die zich voortplant in de midgut van de tseetseevlieg. De eerste drie beelden tonen bestaande wijzen van weergave: optische fluorescentiemicroscopie (Fig., 4A), de differentiële microscopie van het interferentiecontrast (Fig. 4B), en TEM (vijg. 4C). De sterkte van bestaande technieken is duidelijk: gelokaliseerde het merken in fluorescentie en gedetailleerde secties in TEM. Onbehandeld optisch (vijg. 4B) en nat-SEM (vijg. 4D) beelden omlijnen de grenzen van de cel, maar zijn laag in contrast en gebrek aan detail. Beide benadrukken de kern, maar andere organellen die in het differentiële interferentie contrast beeld verschijnen zijn niet duidelijk geïdentificeerd, terwijl het nat-SEM beeld de lipide druppels tot een voordeel brengt. Osmium tetroxide kleuring (Fig., 4E ) is niet zo nuttig in dit systeem, die vooral de lipidedruppeltjes en sommige ongeïdentificeerde binnenorganellen benadrukken. De sterkste beeldvorming wordt gezien in Fig. 4F, waarvoor uranylacetaatkleuring werd gebruikt. Het voordeel van intacte weergave waarmee de volledige cel kan worden gezien (samen met zijn fijne interne structuren die in detail kunnen worden waargenomen) is duidelijk, vooral in vergelijking met tem weergave (Fig. 4C). Tenslotte, nat-SEM beeldvorming van geheel-cel – specifieke markering met antilichamen tegen de belangrijkste glycosylphosphatidylinositol-verankerde oppervlaktecoating eiwit EP procycline (10) wordt getoond in Fig., 4 G en H . Interessant, is EP procyclin gekend om de gehele cel uniform te behandelen, maar het waargenomen signaal is geclusterd. We schrijven dit toe aan de neiging van de onderliggende lipidenvlotten om te clusteren onder invloed van antilichamen, een proces dat fixatie in formaldehyde niet kan voorkomen. De gouden markers verklaren ook de driedimensionale conformatie van de cel op een manier die doet denken aan wat standaard sem beeld kan (een uitstekend, representatief sem beeld van T. brucei kan worden gevonden bij http://tryps.rockefeller.edu/crosslab_intro.html).

uiteraard zal TEM over het algemeen een betere resolutie hebben dan natte SEM, maar de beelden die in het voorbeeld van T. brucei ter vergelijking worden gepresenteerd, zijn “typische” beelden die in hetzelfde laboratorium worden verkregen., Omdat natte SEM in zijn nut anders is dan TEM en optische microscopie, kan in T. brucei het als een belangrijk aanvullend vermogen worden gezien, en men kan verwachten dat het volledige beeld door een combinatie van optische, TEM, en natte-sem techniek zou worden gegeven.

weefselsecties. Natte SEM kan voor dikke specimens zoals weefselfragmenten worden gebruikt door het specimen eenvoudig tegen het membraan te monteren. De beperkte bemonsteringsdiepte van BSEs maakt weergave van een “virtuele sectie mogelijk,” die zich van het oppervlak uitstrekt tot een bepaalde diepte van maximaal een paar micrometers zonder de noodzaak van dunne scheiding.,

Fig. 5 A en B toont de directe visualisatie van onbehandelde weefsels van muis. Fig. 5A is een klein vergrotingsbeeld van hartweefsel. De organisatie van de spiercellen is duidelijk. Inzoomen op één cel (Fig. 5B) geeft een levendig beeld van de kern en intracellulaire organellen, misschien mitochondria, en hun verspreiding in de cel. Zoals hierboven voor gekweekte cellen getoond, is het bevlekken van weefsels voordelig maar niet noodzakelijk en kan de visualisatie van vele eigenschappen verbeteren. Fig. 5 C en D toont een gebied van de nierschors van een rat., Het bevlekken (kaliumferricyanide) accentueert de algemene organisatie en celcontacten binnen de epithelia van de niertubuli. De zorgvuldige aanpassing van het bevlekken en beeldvormingsvoorwaarden kan verschillende en aanvullende informatie zoals weefselarchitectuur onthullen; B.V., de weefsels bevlekt met uranylacetaat opbrengst een duidelijk beeld van de extracellulaire matrijs (gegevens niet getoond).

gelijktijdige Fotonenverzameling (Cl). BSE-detectie in natte SEM kan worden aangevuld met de gelijktijdige verzameling van fotonen., De aftastenelektronenstraal wekt moleculen in de steekproef op, die dan licht bij kenmerkende golflengten (CL) kunnen uitzenden. De lichtintensiteit wordt dan gebruikt om een beeld van de distributie van sprankelende molecules af te leiden, of endogeen aan de cel of etiketten die extraneously kunnen worden geïntroduceerd. Dit beeld wordt gelijktijdig met de weergave door BSE bij een resolutie verkregen die door elektronenmaterieinteracties wordt beperkt en niet door lichtdiffractie (6). We hebben een lichtgids in de vloeistof onder het monster ingevoegd, die het uitgezonden licht naar een fotomultiplier leidt., Deze opstelling zorgt voor een goede koppeling en efficiënte verzameling van de fotonen die door de elektronenbundel worden opgewekt zonder de efficiëntie van gelijktijdige BSE-detectie in gevaar te brengen.

Fig. 6 toont onbehandelde CHO-cellen, gelijktijdig gevisualiseerd door BSE en fotonen. In Fig. 6A, worden de celgrenzen duidelijk geschetst in de elektronenbeeldvormingswijze, en de kern (samen met zijn nucleoli) zijn prominent, evenals de donkere ≈1-µm vlekken rond de kern. Deze verschijnen in het cytoplasma van alle eukaryotische cellen die we hebben onderzocht, en hoewel hun aantal varieert, worden ze meestal verspreid rond de kern., In de CL afbeelding getoond in Fig. 6B, de celoverzicht en de kern zijn duidelijk gedefinieerd, indicatief voor een verdeling van sprankelende molecules (gelijkend op autofluorescentie) in de cel. In deze modus worden dezelfde vlekken gekenmerkt door een hoge emissie van fotonen. De combinatie van een hoog kathodoluminescent signaal en een hoog koolstofgehalte is typisch voor lipidedruppels (11), die deelnemen aan de energieopslag van de cel (12)., Een onafhankelijke test van het toevoegen van 200 µM oliezuur veroorzaakte een sterke proliferatie van deze druppels in de cel (gegevens niet getoond), consistent met de notie dat de waargenomen vlekken lipidedruppeltjes zijn.

natte SEM heeft een voordeel ten opzichte van standaard sem-technieken voor het behoud van lipiden, vooral in grote aggregaten zoals lipidendruppels. Het elimineren van de behoefte aan het drogen bespaart de lipiden van organische oplosmiddelen die hen kunnen oplossen. Hoewel osmiumbehandeling sommige lipidebilagen zal behouden, reageert het osmium in grotere aggregaten snel om een externe korst te creëren die osmium niet binnenlaat, waardoor de aggregaten kwetsbaar zijn voor verdere organische-oplosmiddelbehandeling., In cryogene preparaten is de neiging van het splitsingsproces om langs lipide–watergrenzen te barsten ook een gevaar voor grote lipidestructuren.

beeldvorming met hoge resolutie van markers is een zeer wenselijk vermogen van de CL detectiemodus, waarbij de ontwikkeling van labels voor specifieke moleculen in cellen vereist is. In Fig. 9, die als ondersteunende informatie op de PNAS-website wordt gepubliceerd, tonen we aan dat standaard fluorescerende kralen met een diameter van 0,2 µm fotonen intens onder de elektronenbundel uitstoten en kunnen worden afgebeeld met een resolutie van ≈100 nm (7)., Beeldvorming van kleinere kralen wordt beperkt door lage helderheid, waardoor de ontwikkeling van gespecialiseerde scintillatie kralen bij kleine diameter . Omdat het mechanisme voor opwinding van scintillation het sterkst is wanneer de bundel direct op de parel beà nvloedt, verwachten wij dat dit de resolutie van fluorescente weergave een orde van grootte voorbij die beschikbaar met optische microscopie kan uitbreiden.