det kræver en reel indsats for at holde din grundlæggende viden om molekylær og cellebiologi frisk, ud over alt andet du skal gøre. Ville det ikke være dejligt, hvis der var et sted, hvor du kunne finde letlæselige artikler, der giver dig mulighed for at børste op på disse grundlæggende på bare et par minutter?jeg håber du sagde “ja”, fordi dette er formålet med min” det grundlæggende: “serie af artikler, som vi allerede har, og vil fortsætte med at, bringe til dig med jævne mellemrum. Denne artikel forklarer det grundlæggende i DNA-ligering.,
din DNA-Ligationskammerat: DNA-Ligase
DNA-ligase (EC 6.5.1.1) er en .ymet i hjertet af DNA-ligeringsreaktionen. Det forbinder kovalent fosfat-rygraden i DNA med stumpe eller kompatible sammenhængende ender (se figur 1), og det er naturligt at reparere dobbeltstrengbrud i DNA-molekyler. I molekylærbiologi er det almindeligt anvendt til indsættelse af restriktionsen .ymgenererede DNA-fragmenter i vektor backbones. Kommercielle ligaser leveres med en reaktionsbuffer indeholdende ATP og Mg2+, som begge er essentielle for ligaseaktivitet., Da ATP kan blive beskadiget ved gentagne fryse-optøningscyklusser, anbefales det at lave alikvoter af bufferen (se min artikel “5 DNA-ligeringstips”).
Figur 1. Sammenhængende og stumpe ender, klar til DNA ligering!
de to trin i DNA-ligeringsreaktionen
selve DNA-ligeringsreaktionen har to grundlæggende trin. For det første skal DNA-enderne kollidere tilfældigt og forblive sammen længe nok til, at ligasen kan slutte sig til dem. Dette er den mest ineffektive del af reaktionen, men er lettere ved lave temperaturer. Hvorfor?, Nå, som du sikkert vil vide, bevæger alle molekyler sig hurtigere ved højere temperaturer, så du kan forestille dig, at det bliver lettere for to DNA-ender at kollidere og forblive sammen, hvis de forsigtigt flyder gennem opløsningen ved lav temperatur, snarere end at suse rundt, som de ville være ved højere temperaturer. For sammenhængende ender er der en yderligere grund; lavere temperaturer stabiliserer hydrogenbindingen mellem de komplementære nukleotider, hvilket virkelig hjælper med at holde tingene på plads.
Figur 2., En .ymatisk reaktion af DNA-ligering
det andet trin er den en .ymatiske reaktion, der er vist skematisk i figur 2.. DNA-ligase katalyserer sammenføjningen af 3 ‘- OH til 5 ‘ – phosphatet via en totrinsmekanisme. Først overføres amp-nukleotidet, som er bundet til en lysinrest i en .ymets aktive sted, til 5’ – phosphatet. Derefter angribes AMP-phosphatbindingen af 3 ‘ – OH, der danner den kovalente binding og frigiver AMP. For at give en .ymet mulighed for at udføre yderligere reaktioner skal forstærkeren på en .ymets aktive sted genopfyldes af ATP.,
Her er hvorfor vi udfører DNA-Ligation ved lave temperaturer kan hjælpe
Den DNA-ligase enzym har optimale aktivitet ved 25°C, så de ligation reaktion er udført ved en temperatur, der er et trade-off mellem optimale temperaturer for at bringe DNA-ender sammen (1°C) og så den enzymatiske reaktion standses (25°C). Normalt er 1 time ved 16 C C fint, men da at bringe DNA-enderne sammen, er den mindst effektive del af reaktionen, der favoriserer dette ved at sænke temperaturen til 4.C, kan give endnu mere effektivitet. Imidlertid vil en soymet arbejde meget langsomt ved denne temperatur, så en lang (f. eks., natten over) inkubationstid er påkrævet.
oprindeligt offentliggjort den 31.oktober 2007; opdateret og genudgivet den 5. December 2014.
har dette hjulpet dig? Så kan du dele med dit netværk.
