DISKUSSION
Den Gram-pletten er den mest udbredte farvning procedure i bakteriologi. Det kaldes en differentieret plet, da den skelner mellem Gram-positive og Gram-negative bakterier. Bakterier, der pletter lilla med Gram-farvningsproceduren, kaldes Gram-positive; dem, der pletter pink, siges at være Gram-negative. Udtrykkene positive og negative har intet at gøre med elektrisk ladning, men betegner blot to forskellige morfologiske grupper af bakterier.,
Gram-positive og Gram-negative bakterier pletter forskelligt på grund af grundlæggende forskelle i strukturen af deres cellevægge. Bakteriecellevæggen tjener til at give organismen dens størrelse og form samt til at forhindre osmotisk lysis. Materialet i bakteriecellevæggen, som giver stivhed, er peptidoglycan.
I elektron micrographs, Gram-positive cellevæg, vises som en bred, tæt væg 20-80 nm tyk og består af mange sammenhængende lag af peptidoglycan (figur 1A og 1B). Kemisk set er 60 til 90% af den Gram-positive cellevæg peptidoglycan., Sammenvævet i cellevæggen af Gram-positive er teichoesyrer. Teichoesyrer, der strækker sig gennem og ud over resten af cellevæggen, er sammensat af polymerer af glycerol, fosfater og sukkeralkoholen ribitol. Nogle har en lipid fastgjort (lipoteichoic acid). Den ydre overflade af peptidoglycan er besat med proteiner, der adskiller sig fra bakteriens stamme og Art.,
Den Gram-negative cellevæg, på den anden side, indeholder kun 2-3 lag af peptidoglycan, og er omgivet af en ydre membran, der består af fosfolipider, lipopolysaccharide, lipoprotein, og proteiner (Figur 2A og 2B). Kun 10% – 20% af den Gram-negative cellevæg er peptidoglycan. Phospholipiderne er hovedsageligt placeret i det indre lag af den ydre membran, ligesom lipoproteinerne, der forbinder den ydre membran med peptidoglycan., Lipopolysacchariderne, der er placeret i det ydre lag af den ydre membran, består af en lipiddel kaldet lipid A indlejret i membranen og en polysacchariddel, der strækker sig udad fra bakterieoverfladen. Den ydre membran indeholder også et antal proteiner, der adskiller sig fra bakteriens stamme og Art.,
For yderligere information om Gram-negative og Gram-positive cellevæg, se følgende Lære Objekter i din Forelæsning Guide:
- Den Prokaryote Celle Væg Enhed 1, Afsnit IIB2
- Den Gram-Positive cellevæg; Unit 1, Afsnit IIB2a
- Gram-Negative cellevæg; Unit 1, Afsnit IIB2b
Gram farvning-proceduren indebærer fire grundlæggende trin:
1. Bakterierne farves først med det grundlæggende farvestof crystal violet. Både Gram-positive og Gram-negative bakterier bliver direkte farvede og vises lilla efter dette trin.,
2. Bakterierne behandles derefter med Grams iodopløsning. Dette gør det muligt at bevare pletten bedre ved at danne et uopløseligt krystal violet-jodkompleks. Både Gram-positive og Gram-negative bakterier forbliver lilla efter dette trin.
3. Grams affarvningsmiddel, en blanding af ethylalkohol og acetone, tilsættes derefter. Dette er forskellen trin. Gram-positive bakterier bevarer krystalviolet-jodkomplekset, mens Gram-negative affarves.
4. Endelig påføres kontrasten safranin (også et basisk farvestof)., Da de Gram-positive bakterier allerede er farvede lilla, påvirkes de ikke af modstanden. Gram-negative bakterier, som nu er farveløse, bliver direkte farvet af safranin. Således ser Gram-positive lilla ud, og Gram-negative ser lyserøde ud.
. Daniel Cavanaugh, Mark Keen, forfattere, Licenseret til brug, ASM MicrobeLibrary.,
Med den nuværende teori bag Gram farvning, det menes, at i Gram-positive bakterier, krystal violet og jod kombinere til at danne et større molekyle, der falder ud i cellen. Alkohol / acetonblandingen forårsager derefter dehydrering af det flerlagede peptidoglycan, hvilket reducerer rummet mellem molekylerne og får cellevæggen til at fange krystalviolet-jodkomplekset i cellen., I tilfælde af Gram-negative bakterier opløser alkohol/acetonblandingen, der er et lipidopløsningsmiddel, den ydre membran i cellevæggen og kan også beskadige den cytoplasmatiske membran, som peptidoglycan er fastgjort til. De få lag af peptidoglycan er ikke i stand til at bevare krystalviolet-jodkomplekset, og cellen affarves.
det er vigtigt at bemærke, at Gram-positivitet (evnen til at bevare det lilla krystal violet-jodkompleks) ikke er et alt-eller-intet-fænomen, men et spørgsmål om grad., Der er flere faktorer, der kan resultere i en Gram-positiv organismefarvning Gram-negativt:
1. Den anvendte metode og de anvendte teknikker. Overophedning under varmefiksering, over affarvning med alkohol og endda for meget vask med vand mellem trin kan resultere i, at Gram-positive bakterier mister krystalviolet-jodkomplekset.
2. Kulturens alder. Kulturer mere end 24 timer gamle kan miste deres evne til at bevare krystalviolet-jodkomplekset.
3. Organismen selv., Nogle Gram-positive bakterier er mere i stand til at bevare krystalviolet-jodkomplekset end andre.
derfor skal man bruge meget præcise teknikker i gramfarvning og fortolke resultaterne med skøn.
Tryticase Soy agar plade kulturer af Escherichia coli (en lille, Gram-negative bacillus) og Staphylococcus epidermidis (en Gram-positiv coccus med staphylococcus arrangement).
PROCEDURE (skal udføres individuelt)
1., Escherichia coli
en. Varme-fix en udstrygning af Escherichia coli som følger:
1. Brug dråbeflasken med deioniseret vand, der findes i dit farvestativ, til at placere 1/2 af en dråbe vand i normal størrelse på en ren dias ved at røre dråbeflasken til diaset (Figur 1). Altenately, bruge din steriliseret podning løkke til at placere en dråbe af deioniseret vand på objektglasset.
2., Brug din sterile inokuleringssløjfe til aseptisk at fjerne en lille mængde af kulturen fra agaroverfladen og rør den forsigtigt 2 – 3 gange til dråben, indtil vandet bliver synligt overskyet (figur 2). En god udstrygning med den korrekte mængde bakterier er vigtig for gramfarvning.
- for mange bakterier på objektglasset kan resultere i underfarvning; for få kan føre til overfarvning.
3. Forbrænd de resterende bakterier på inokuleringssløjfen., Hvis der tilsættes for meget kultur til vandet, vil du ikke se farvede individuelle bakterier, og du har muligvis ikke en pålidelig Gram-plet.
4. Efter at inokuleringssløjfen er afkølet, spredes suspensionen over ca. halvdelen af objektglasset for at danne en tynd film. Et korrekt forberedt smear med den rigtige mængde bakterier skal ligne Fig. 3.
5. Lad denne tynde suspension lufttørre helt (figur 4). Smøret skal være helt tørt, før glideren er varmefast!
6., For at opvarme bakterierne på objektglasset skal du tage det lufttørrede objektglas op med dækglaspincet og holde bunden af objektglasset modsat udstrygningen nær åbningen af mikroincineratoren i 10 sekunder (figur 5) som demonstreret af din instruktør. Hvis objektglasset ikke er opvarmet nok, vil alle bakterierne vaske af. Hvis det er overophedet, kan bakteriens strukturelle integritet blive beskadiget.
b. pletter med Hucker ‘ s crystal violet i et minut (figur 6). Vask forsigtigt med vand (Figur 7). Ryst det overskydende vand af, men tør ikke tør mellem trinene.
c., Stain med Grams jodopløsning i et minut (figur 8) og vask forsigtigt med vand. d. affarvning ved at tage objektglasset op og lade Gram ‘ s affarvning løbe ned ad objektglasset, indtil den lilla bare holder op med at strømme i bunden af objektglasset (figur 9).
- sørg for, at hele smøret er jævnt affarvet, og at du ikke underfarver eller overfarver.
- vask straks med vand.
e. pletter med safranin i et minut (Figur 10)., Når du vasker det overskydende safranin af, skal du være meget forsigtig med at vaske forsigtigt og kort, da det er muligt at vaske noget af sarfanin i bakterien.
f. Blot tør (Figur 11) og observere ved hjælp af olie nedsænkning mikroskopi.
2. Staphylococcus epidermidis
en. Varme-fix en udstrygning af Staphylococcus epidermidis som følger:
1. Brug dråbeflasken med deioniseret vand, der findes i dit farvestativ, til at placere 1/2 af en dråbe vand i normal størrelse på en ren dias ved at røre dråbeflasken til diaset (Figur 1)., Altenately, bruge din steriliseret podning løkke til at placere en dråbe af deioniseret vand på objektglasset.
2. Brug din sterile inokuleringssløjfe til aseptisk at fjerne en lille mængde af kulturen fra agaroverfladen og rør den forsigtigt 2 – 3 gange til dråben, indtil vandet bliver synligt overskyet (figur 2).
- for mange bakterier på objektglasset kan resultere i underfarvning; for få kan føre til overfarvning.
3. Forbrænd de resterende bakterier på inokuleringssløjfen., Hvis der tilsættes for meget kultur til vandet, vil du ikke se farvede individuelle bakterier, og du har muligvis ikke en pålidelig Gram-plet.
4. Efter at inokuleringssløjfen er afkølet, spredes suspensionen over ca. halvdelen af objektglasset for at danne en tynd film (figur 3).
5. Lad denne tynde suspension lufttørre helt (figur 4). Smøret skal være helt tørt, før glideren er varmefast!
6., For at opvarme bakterierne på objektglasset skal du tage det lufttørrede objektglas op med dækglaspincet og holde bunden af objektglasset modsat udstrygningen nær åbningen af mikroincineratoren i 10 sekunder (figur 5) som demonstreret af din instruktør. Hvis objektglasset ikke er opvarmet nok, vil alle bakterierne vaske af. Hvis det er overophedet, kan bakteriens strukturelle integritet blive beskadiget.
b. pletter med Hucker ‘ s crystal violet i et minut (figur 6). Vask forsigtigt med vand (Figur 7). Ryst det overskydende vand af, men tør ikke tør mellem trinene.
c., Stain med Grams jodopløsning i et minut (figur 8) og vask forsigtigt med vand. d. affarvning ved at tage objektglasset op og lade Gram ‘ s affarvning løbe ned ad objektglasset, indtil den lilla bare holder op med at strømme i bunden af objektglasset (figur 9).
- sørg for, at hele smøret er jævnt affarvet, og at du ikke underfarver eller overfarver.
- vask straks med vand.
e. pletter med safranin i et minut (Figur 10)., Når du vasker det overskydende safranin af, skal du være meget forsigtig med at vaske forsigtigt og kort, da det er muligt at vaske noget af sarfanin i bakterien.
f. Blot tør og observere ved hjælp af olie nedsænkning mikroskopi.
3. Sørg for, at du forsigtigt hælder det brugte farvestof i din farvningsbakke i affaldsfarveindsamlingsbeholderen, ikke ned i vasken.
© Hussein Shoeb, forfatter. Licenseret til brug, ASM MicrobeLibrary.
B., KAPSELFARVEN
diskussion
mange bakterier udskiller en slimet, viskøs belægning kaldet en kapsel eller glycocaly.. Dette er normalt sammensat af polysaccharid, polypeptid eller begge dele.
evnen til at producere en kapsel er en arvelig egenskab af organismen, men kapslen er ikke en absolut vigtig cellulær komponent. Kapsler produceres ofte kun under specifikke vækstbetingelser. Selvom det ikke er afgørende for livet, hjælper kapsler p robust bakterier til at overleve i naturen., Kapsler hjælper mange patogene og normale florabakterier til oprindeligt at modstå fagocytose af værtsens fagocytiske celler. I jord og vand hjælper kapsler med at forhindre bakterier i at blive opslugt af proto .oer. Kapsler hjælper også mange bakterier med at klæbe til overflader og dermed modstå skylning. Det gør det også muligt for mange bakterier at danne biofilm. En biofilm består af lag af bakteriepopulationer, der klæber til værtsceller og indlejret i en fælles kapselmasse.,
For yderligere oplysninger om bakteriel kapsler, skal du se følgende Lære Objekter i din Forelæsning Guide:
- Glycocalyx (Kapsel) og S-Lag, Unit 1, Afsnit IIB4a
- Evnen til at Modstå Phagocytic Engulfment; Unit 3, Afsnit B5b
ORGANISME
Skummetmælk bouillon kultur Enterobacter aerogenes. Skummetmælken leverer vigtige næringsstoffer til kapselproduktion og giver også en let farvelig baggrund.
PROCEDURE (skal udføres individuelt)
1., Rør op Skummetmælksbuljongkulturen med din løkke, og anbring 2-3 løkker Enterobacter aerogenes på et mikroskop.
2. Brug din inokuleringssløjfe til at sprede prøven ud for at dække cirka en tomme af diaset.
3. Lad det lufttørre helt. Må ikke varme Fi.. Kapsler klæber godt til glas, og varme kan ødelægge kapslen.
4. Stain med krystal violet i et minut.
5. Vask det overskydende farvestof af med 20% kobbersulfatopløsning.
6. Ryst den overskydende kobbersulfatopløsning af og tør straks tør.
7. Overhold ved hjælp af olie nedsænkning mikroskopi., Organismen og mælken tørret på diaset vil afhente det lilla farvestof, mens kapslen forbliver farveløs.
8. Sørg for, at du forsigtigt hælder det brugte farvestof i din farvningsbakke i affaldsfarveindsamlingsbeholderen, ikke ned i vasken.
9. Overhold demonstrationskapselfarven af Streptococcus lactis, en indkapslet bakterie, der er normal flora i mælk.
A. Gramfarven
lav tegninger af hver bakterie på dit Gramfarvepræparat.,
|
|
|
| Color = Gram reaction = Shape = |
Color = Gram reaction = Shape = Arrangement = |
B., Kapslen Pletten
lav en tegning af din kapsel pletten forberedelse af Enterobacter aerogenes og demonstration kapsel pletten af Streptococcus pneumoniae.
Kapsel pletten af
Streptococcus lactis
