Opdagelsen af Mitokondrie-DNA
Nogle begreber tager den videnskabelige verden med storm, men andre erobre det, først efter mange træfninger. Opdagelsen af mitokondrielt DNA (mtDNA) tilhører denne anden kategori. Biokemikere, histologer og elektronmikroskopister havde set DNA i mitokondrier i årevis, men de fleste af dem var ikke klar til tanken om, at DNA ‘ et virkelig hørte der. Dette kan forklare, hvorfor lærebogsberetninger om mtDNA næsten aldrig fortæller, hvordan dette DNA blev opdaget.,
Efter den grundlæggende bygning plan af de eukaryote celle var blevet afsløret i begyndelsen af 1950’erne ved elektron micrographs af Palade, Sjöstrand, og andre, biokemikere omfavnede de Duve ‘ s dogme om, at alle makromolekyle havde én, og kun én, intracellulære placering. I analysen af celle fraktioner, cytochrom oxidase blev taget som en markør for mitokondrier, nicotianamide adenin dinucleotide fosfat (NADPH)–cytochrom c-reduktase til endoplasmatisk reticulum, og DNA til kernen., I betragtning af denne sindstilstand er det let at forstå, hvorfor tilstedeværelsen af DNA i mitokondrielle fraktioner generelt blev tilskrevet forurening med nukleare fragmenter. Histokemiske DNA-pletter, såsom Feulgen-reaktionen, farvede også kinetoplasterne af trypanosomer og’ Nebenkern ‘ af insektspermato .oer, men på det tidspunkt blev det endnu ikke anerkendt, at disse strukturer faktisk var usædvanlige mitokondrier., Massive mængder ekstranukleært DNA blev også påvist i cytoplasmaet af amfibiske oocytter, men det tog mange år at indse, at dette DNA faktisk var mtDNA, hvis overflod afspejlede den enorme mængde mitokondrier i disse store celler. I 1961, i det Femte Årlige Møde i American Society for Cell Biology i Chicago, Hans Ris viste electron micrographs af mitokondrier med indeslutninger, der ligner DNA-holdige nucleoids af bakterier og gjort den kætterske forslag, som mitokondrier og kloroplaster) indeholder deres eget DNA., I et papir, der udkom i det følgende år, Ris og Risalter s Plaut yderligere dokumenteret og udvidet disse bemærkninger. Snart derefter bekræftede biokemiske og morfologiske beviser fra flere grupper tilstedeværelsen af DNA i chloroplaster.
opdagelsen af kloroplast DNA lavet biokemikere tage et nyt kig på tidlige fund af Margaret Mitchell og Boris Ephrussi, at visse mutationer, der påvirker mitokondrie-funktion i formen Neurospora crassa og gæren Saccharomyces cerevisiae blev ikke arvet ifølge mendels love., Det syntes fristende at spekulere, at de ukendte ‘ekstrachromosomale faktorer’ impliceret i disse mutationer var, faktisk, mtDNA.
i 1962 var grunden til begrebet mtDNA således godt forberedt, men selve konceptet blev ikke almindeligt accepteret. I eftertid ser det ud til, at det videnskabelige samfund ventede på overbevisende undersøgelser, der dokumenterede eksistensen af mtDNA ved flere forskellige metoder.
en af disse undersøgelser kom fra elektronmikroskopisterne Margit MK Nass og Sylvan Nass, som derefter arbejdede på Instituteenner Gren-Instituttet ved Stockholms Universitet., De viste, at matrix af osmium-fast chick embryo mitokondrier, der er indeholdt tråd-lignende indeslutninger, hvis udseende efter forskellige fikseringen nøje parallel, der af histon-gratis DNA nucleoid af bakterier: efter fiksering med osmium tetroxide, de optagelser viste sig klumpet og som stænger med en diameter på ~400 Å; fiksering af væv med osmium tetroxide efterfulgt af behandling med uranyl acetat, før dehydrering gjorde dem til at fremstå som 15-30-Å tynde fibre., Endnu mere overbevisende bevis for tilstedeværelsen af DNA i disse indeslutninger var observationen af, at indeslutningerne kunne fjernes ved at behandle det let fikserede embryonale væv med DNase. Behandling med pepsin, med RNase eller med DNase-fri bufferkontrol var ineffektiv. Klarheden af disse elektronmikrografer og de omhyggelige kontroller, der var inkluderet, havde en overbevisende indvirkning på cellebiologer. MMK Nass og S Nass offentliggjort deres arbejde i to back-to-back papirer i en 1963 udgave af Journal of Cell Biology., På det tidspunkt, imidlertid, cellebiologi og biokemi var stadig temmelig forskellige discipliner, og de fleste biokemikere gennemgik ikke tidsskrifter, der var afsat til cellebiologi. Det tog derfor et stykke tid, før resultaterne fra MMK Nass og S Nass kom ind i det biokemiske samfunds bevidsthed.
På omkring samme tid, Ellen Haslbrunner, Hans Tuppy, og Schatz ved Biokemisk Institut ved Universitetet i Wien, var at forsøge at finde en biokemisk basis for extrachromosomal mutationer, der afskaffede den respiratoriske funktion i gær S. cerevisiae., I begyndelsen af 1960 ‘erne var mange biokemikere stadig tilbageholdende med at betragte’ åndedrætsgranulerne ‘ af gær som bona fide mitokondrier, som placerede forskningen fra Haslbrunner et al. langt uden for mainstream af mitokondrie biokemi i USA og andre steder.
for at se efter DNA i mitokondrier blev der valgt en biokemisk tilgang. Gær mitokondrier blev renset ved de bedste metoder til rådighed, og deres DNA-indhold blev målt ved den hævdvundne ‘Diesche’ farve reaktion., Et par år før havde de Duve og kolleger vist, at centrifugering af subcellulære fraktioner til ligevægt i en densitetsgradient ofte gav en ren adskillelse af forskellige organeller. Overraskende, den sædvanlige saccharose forløb ikke adskille gær mitokondrier fra nukleare fragmenter, men når saccharose blev erstattet med X-ray kontrasterende agent ‘Urografin’, mitokondrierne dannet en yderst skarp band, og DNA var til stede i to fraktioner: de fleste var på bunden af den centrifugerør, og en meget lille mængde, men diskrete højdepunkt faldt sammen netop med, at af mitokondrier., DNA ‘ et i bundfraktionen blev let fordøjet af DNase og tilsyneladende repræsenteret nukleart DNA. DNA ‘ et i mitokondriefraktionen blev ikke let fordøjet af DNase, medmindre organellerne først blev forstyrret med trichloreddikesyre; formodentlig repræsenterede det DNA indesluttet af mitokondriemembranerne. Dens koncentration var meget konstant mellem forskellige eksperimenter – mellem 1 og 4 µg mg−1 mitokondrielt protein. Urografin-oprensede mitokondrier fra rottelever, rottenyrer og kvæghjerte – indeholdt næsten 10 gange mindre DNA, mellem 0,2 og 0,6 µg DNA pr. mg protein., Den typiske pattedyrsmitochondrion blev beregnet til at indeholde 3 10-1 10-17 g DNA. Hvis man antager, at DNA ‘ et var dobbeltstrenget, kunne det ikke kode mere end 1, 2 MDa polypeptidkæder. Dette resultat blev anset for vigtigt, fordi det stærkt udelukket muligheden for, at mtDNA kodede alle mitokondrielle proteiner. I dag er denne tidlige beregning af Haslbrunner et al. kunne udfordres af flere grunde, men det kom bemærkelsesværdigt tæt på virkeligheden: de 13 polypeptider kodet af pattedyrs mtDNA har en samlet masse på 0.,423 MDa, og resten af kodningspotentialet er stort set tegnede sig for gener for ribosomal og overføre RNA ‘ er, samt af det faktum, at mitokondrier normalt har mere end en kopi af deres DNA-genom.
