het kost een echte inspanning om je basiskennis van moleculaire en celbiologie vers te houden, naast alles wat je nog moet doen. Zou het niet geweldig zijn als er een plek was waar je gemakkelijk te lezen artikelen kon vinden die je in staat stellen om op te frissen over die basisprincipes in slechts een paar minuten?
… Ik hoop dat je “ja” hebt gezegd, want dit is het doel van mijn “the Basics:” serie artikelen, die we al regelmatig hebben en zullen blijven brengen. Dit artikel legt de basisprincipes van DNA ligation uit.,
uw DNA-Ligatiemaatje: DNA-Ligase
DNA-ligase (EC 6.5.1.1) is het enzym dat de kern vormt van de DNA-ligatiereactie. Het sluit covalent aan bij de fosfaatrug van DNA met botte of compatibele cohesieve uiteinden (zie Figuur 1) en het is natuurlijke rol in het herstellen van dubbele bundel breuken in DNA-moleculen. In moleculaire biologie wordt het algemeen gebruikt voor de toevoeging van fragmenten van beperkingsenzym-geproduceerde DNA in vector backbones. Commerciële ligases worden geleverd met een reactiebuffer die ATP en Mg2+ bevatten, die beide essentieel zijn voor ligaseactiviteit., Aangezien ATP kan worden beschadigd door herhaalde bevriezen-ontdooien cycli, is het raadzaam om aliquots van de buffer (zie mijn artikel “5 DNA ligation tips”).
figuur 1. Samenhangende en stompe uiteinden, klaar voor DNA ligatie!
de twee stappen van de DNA-ligatiereactie
de DNA-ligatiereactie zelf heeft twee basisstappen. Ten eerste moeten de DNA-einden toevallig botsen en lang genoeg bij elkaar blijven voor de ligase om zich bij hen aan te sluiten. Dit is het meest inefficiënte deel van de reactie, maar is gemakkelijker bij lage temperaturen. Waarom?, Zoals je waarschijnlijk weet, bewegen alle moleculen sneller bij hogere temperaturen, dus je kunt je voorstellen dat het makkelijker zal zijn voor twee DNA-uiteinden om samen te botsen en bij elkaar te blijven als ze zachtjes door de oplossing zweven bij lage temperatuur, in plaats van rond te suizen zoals ze zouden zijn bij hogere temperaturen. Voor samenhangende uiteinden is er een extra reden; lagere temperaturen stabiliseren de waterstofbinding tussen de complementaire nucleotiden, wat echt helpt om dingen op hun plaats te houden.
Figuur 2., Enzymatische reactie van DNA ligatie
de tweede stap is de enzymatische reactie, die schematisch wordt weergegeven in Figuur 2.. De ligase van DNA katalyseert de verbinding van 3′-OH aan 5 ‘ – fosfaat via een tweestapsmechanisme. Eerst wordt het AMP-nucleotide, dat aan een lysineresidu in de actieve plaats van het enzym in bijlage is, overgebracht naar het 5′-fosfaat. Dan wordt de AMP-fosfaatbinding aangevallen door 3’-OH, die de covalente binding vormen en AMP vrijgeven. Om het enzym in staat te stellen verdere reacties uit te voeren moet het AMP in de actieve plaats van het enzym worden aangevuld door ATP.,
hier is waarom het uitvoeren van DNA ligatie bij lage temperaturen kan helpen
het DNA ligase enzym heeft optimale activiteit bij 25°C dus de ligatie reactie wordt uitgevoerd bij een temperatuur die een trade-off is tussen de optimale temperaturen voor het samenbrengen van de DNA-uiteinden (1°C) en de enzymatische reactie (25°C). Normaal is 1hr bij 16°C prima, maar aangezien het samenbrengen van de DNA-einden het minst efficiënte deel van de reactie is dat dit begunstigt door de temperatuur tot 4°C te verlagen, kan nog meer efficiency geven. Echter, het enzym zal zeer langzaam werken bij deze temperatuur dus een lange (bijv., overnachting) incubatietijd is vereist.
oorspronkelijk gepubliceerd op 31 oktober 2007; bijgewerkt en opnieuw gepubliceerd op 5 December 2014.
heeft dit u geholpen? Dan kunt u delen met uw netwerk.
