discussie
De Gramkleur is de meest gebruikte kleuringprocedure in de bacteriologie. Het wordt een differentiële vlek genoemd aangezien het tussen Gram-positieve en Gram-negatieve bacteriën onderscheidt. De bacteriën die purper met de het bevlekken procedure van het Gram bevlekken worden genoemd Gram-positief; die die roze bevlekken worden gezegd om Gram-negatief te zijn. De termen positief en negatief hebben niets te maken met elektrische lading, maar verwijzen eenvoudig naar twee verschillende morfologische groepen bacteriën.,
grampositieve en gramnegatieve bacteriën kleuren verschillend vanwege fundamentele verschillen in de structuur van hun celwanden. De bacteriële celwand dient om het organisme zijn grootte en vorm te geven evenals om osmotische lysis te verhinderen. Het materiaal in de bacteriële celwand dat stijfheid verleent is peptidoglycaan.
bij elektronenmicrografen verschijnt de grampositieve celwand als een brede, dichte wand van 20-80 nm dik en bestaande uit talrijke onderling verbonden lagen peptidoglycaan (figuren 1A en 1B). Chemisch is 60 tot 90% van de grampositieve celwand peptidoglycaan., In de celwand van Gram-positief zijn teichoic zuren verweven. Teichoic zuren, die door en voorbij de rest van de celwand, zijn samengesteld uit polymeren van glycerol, fosfaten, en de suikeralcohol ribitol. Sommige hebben een lipide bevestigd (lipoteichoic zuur). De buitenoppervlakte van peptidoglycan is bezaaid met proteã nen die met de stam en species van de bacterie verschillen.,
de gramnegatieve celwand daarentegen bevat slechts 2-3 lagen peptidoglycaan en is omgeven door een buitenmembraan dat bestaat uit fosfolipiden, lipopolysaccharide, lipoproteïne en eiwitten (figuren 2A en 2B). Slechts 10% – 20% van de gramnegatieve celwand is peptidoglycaan. Phospholipids worden gevestigd hoofdzakelijk in de binnenlaag van het buitenmembraan, zoals lipoproteins zijn die het buitenmembraan met peptidoglycan verbinden., De lipopolysacchariden, die in de buitenlaag van het buitenmembraan worden gevestigd, bestaan uit een lipidedeel genoemd lipide a ingebed in het membraan en een polysaccharidedeel dat zich naar buiten van de bacteriële oppervlakte uitstrekt. Het buitenmembraan bevat ook een aantal proteã nen die met de stam en species van de bacterie verschillen.,
voor meer informatie over de gramnegatieve en grampositieve celwand, zie de volgende leerobjecten in uw Lecture Guide:
- De prokaryotische celwand; Eenheid 1, sectie IIB2
- de grampositieve celwand; Eenheid 1, sectie IIB2a
- de gramnegatieve celwand; Eenheid 1, sectie IIB2b
De Gramkleuringsprocedure omvat vier basisstappen:
1. De bacteriën worden eerst bevlekt met de basiskleurstof crystal violet. Zowel Gram-positieve als Gram-negatieve bacteriën worden direct bevlekt en verschijnen paars na deze stap.,
2. De bacteriën worden vervolgens behandeld met Gram ‘ s jodiumoplossing. Hierdoor kan de vlek beter worden behouden door een onoplosbaar kristalviolet-jodiumcomplex te vormen. Zowel Gram-positieve als Gram-negatieve bacteriën blijven paars na deze stap.
3. Gram ‘ s decolorizer, een mengsel van ethylalcohol en aceton, wordt vervolgens toegevoegd. Dit is de differentiële stap. Gram-positieve bacteriën behouden het kristal violet-jodium complex terwijl Gram-negatieve zijn ontkleurd.
4. Ten slotte wordt de contrastain safranine (ook een basiskleurstof) aangebracht., Omdat de grampositieve bacteriën al paars gekleurd zijn, worden ze niet aangetast door de tegenvlek. Gramnegatieve bacteriën, die nu kleurloos zijn, worden direct gekleurd door de safranine. Dus, Gram-positieve verschijnen paars, en Gram-negatieve verschijnen roze. Flash animatie die de interactie van de gramkleurreagentia op moleculair niveau illustreert© Daniel Cavanaugh, Mark Keen, authors, Licensed for use, ASM MicrobeLibrary.,
met de huidige theorie achter gramkleuring wordt aangenomen dat bij Grampositieve bacteriën het kristalviolet en jodium samen een groter molecuul vormen dat in de cel neerslaat. Het alcohol / acetonmengsel veroorzaakt dan uitdroging van het meerlaagse peptidoglycaan, waarbij de ruimte tussen de molecules wordt verminderd en de celwand wordt veroorzaakt om het kristalviolet-jodium complex binnen de cel te vangen., In het geval van gramnegatieve bacteriën lost het alcohol/acetonmengsel, dat een lipidenoplosmiddel is, het buitenmembraan van de celwand op en kan het cytoplasmatische membraan waaraan het peptidoglycaan is gehecht ook beschadigen. De paar lagen peptidoglycan zijn niet in staat om het kristal violet-jodium complex te behouden en de cel is ontkleurd.
Het is belangrijk op te merken dat Grampositiviteit (het vermogen om het paarse kristalviolet-jodiumcomplex te behouden) Geen alles-of-niets-fenomeen is, maar een kwestie van graad., Er zijn verschillende factoren die ertoe kunnen leiden dat een Gram-positief organisme Gram-negatief verkleurt:
1. De gebruikte methode en technieken. Oververhitting tijdens hittefixatie, over ontkleuring met alcohol, en zelfs te veel wassen met water tussen de stappen kan resulteren in Gram-positieve bacteriën die het kristal violet-jodium complex verliezen.
2. Het tijdperk van de cultuur. Culturen die meer dan 24 uur oud zijn, kunnen hun vermogen verliezen om het kristalviolet-jodiumcomplex te behouden.
3. Het organisme zelf., Sommige Grampositieve bacteriën zijn beter in staat om het kristalviolet-jodium complex te behouden dan anderen.
daarom moet men zeer nauwkeurige technieken voor gramkleuring gebruiken en de resultaten met discretie interpreteren.
trypticase-Sojaagarplaatculturen van Escherichia coli (een kleine, gramnegatieve bacil) en Staphylococcus epidermidis (een grampositieve coccus met een staphylococcus-opstelling).
PROCEDURE (afzonderlijk uit te voeren)
1., Escherichia coli
a. Verhit een uitstrijkje van Escherichia coli als volgt:
1. Gebruikend de druppelfles van gedeïoniseerd water in uw het bevlekken rek wordt gevonden, plaats 1/2 van een normale grootte daling van water op een schone dia door de druppelaar aan de dia aan te raken (figuur 1). Altenately, gebruik uw gesteriliseerde inoculerende lijn om een daling van gedeïoniseerd water op de dia te plaatsen.
2., Verwijder met uw steriele inoculerende lus aseptisch een kleine hoeveelheid van de cultuur van het agar – oppervlak en raak deze voorzichtig 2-3 keer aan op de druppel water totdat het water zichtbaar troebel wordt (Figuur 2). Een goed uitstrijkje met de juiste hoeveelheid bacteriën is essentieel voor gramkleuring.
- te veel bacteriën op de dia kunnen leiden tot onder-ontkleuring; te weinig kunnen leiden tot over-ontkleuring.
3. Verbrand de resterende bacteriën op de inoculerende lus., Als er te veel cultuur aan het water wordt toegevoegd, ziet u geen gekleurde individuele bacteriën en heeft u mogelijk geen betrouwbare Gramkleur.
4. Nadat de inoculerende lus is afgekoeld, verdeel je de suspensie over ongeveer de helft van de dia om een dunne film te vormen. Een correct voorbereide uitstrijkje met de juiste hoeveelheid bacteriën moet lijken op Fig. 3.
5. Laat deze dunne suspensie volledig aan de lucht drogen (Figuur 4). Het uitstrijkje moet volledig droog zijn voordat de dia wordt verhit!
6., Om de bacteriën op de dia te verhitten,neemt u de luchtgedroogde dia op met een coverslip pincet en houdt u de onderkant van de dia tegenover het uitstrijkje in de buurt van de opening van de microincinerator gedurende 10 seconden vast (Figuur 5), zoals uw instructeur heeft aangetoond. Als de dia niet genoeg wordt verwarmd, zullen alle bacteriën wegspoelen. Als het oververhit is, kan de structurele integriteit van de bacteriën worden beschadigd.
b. vlek met hucker ‘ s kristalviolet gedurende één minuut (Figuur 6). Was voorzichtig met water (Figuur 7). Schud het overtollige water af, maar dep niet droog tussen de stappen.
c., Beits gedurende 1 minuut met Gram jodiumoplossing (Figuur 8) en was voorzichtig met water.
d. ontkleuren door de dia op te pakken en het Ontkleurmiddel van de Gram van de dia af te laten lopen totdat het paars stopt met stromen aan de onderkant van de dia (figuur 9).
- zorg ervoor dat het hele uitstrijkje gelijkmatig ontkleurd is en dat u niet te weinig ontkleurt of te veel ontkleurt.
- was onmiddellijk met water.
e. vlek met safranine gedurende één minuut (Figuur 10)., Wanneer u de overtollige safranine verwijdert, moet u voorzichtig en kort wassen, omdat het mogelijk is om een deel van de sarfanine in de bacterie weg te spoelen.
f. droog deppen (Figuur 11) en observeer met behulp van olie-immersiemicroscopie.
2. Staphylococcus epidermidis
a. Verhit een uitstrijkje van Staphylococcus epidermidis als volgt:
1. Gebruikend de druppelfles van gedeïoniseerd water in uw het bevlekken rek wordt gevonden, plaats 1/2 van een normale grootte daling van water op een schone dia door de druppelaar aan de dia aan te raken (figuur 1)., Altenately, gebruik uw gesteriliseerde inoculerende lijn om een daling van gedeïoniseerd water op de dia te plaatsen.
2. Verwijder met uw steriele inoculerende lus aseptisch een kleine hoeveelheid van de cultuur van het agar – oppervlak en raak deze voorzichtig 2-3 keer aan op de druppel water totdat het water zichtbaar troebel wordt (Figuur 2).
- te veel bacteriën op de dia kunnen leiden tot onder-ontkleuring; te weinig kunnen leiden tot over-ontkleuring.
3. Verbrand de resterende bacteriën op de inoculerende lus., Als er te veel cultuur aan het water wordt toegevoegd, ziet u geen gekleurde individuele bacteriën en heeft u mogelijk geen betrouwbare Gramkleur.
4. Nadat de inoculerende lus is afgekoeld, verdeel je de suspensie over ongeveer de helft van de dia om een dunne film te vormen (Figuur 3).
5. Laat deze dunne suspensie volledig aan de lucht drogen (Figuur 4). Het uitstrijkje moet volledig droog zijn voordat de dia wordt verhit!
6., Om de bacteriën op de dia te verhitten,neemt u de luchtgedroogde dia op met een coverslip pincet en houdt u de onderkant van de dia tegenover het uitstrijkje in de buurt van de opening van de microincinerator gedurende 10 seconden vast (Figuur 5), zoals uw instructeur heeft aangetoond. Als de dia niet genoeg wordt verwarmd, zullen alle bacteriën wegspoelen. Als het oververhit is, kan de structurele integriteit van de bacteriën worden beschadigd.
b. vlek met hucker ‘ s kristalviolet gedurende één minuut (Figuur 6). Was voorzichtig met water (Figuur 7). Schud het overtollige water af, maar dep niet droog tussen de stappen.
c., Beits gedurende 1 minuut met Gram jodiumoplossing (Figuur 8) en was voorzichtig met water.
d. ontkleuren door de dia op te pakken en het Ontkleurmiddel van de Gram van de dia af te laten lopen totdat het paars stopt met stromen aan de onderkant van de dia (figuur 9).
- zorg ervoor dat het hele uitstrijkje gelijkmatig ontkleurd is en dat u niet te weinig ontkleurt of te veel ontkleurt.
- was onmiddellijk met water.
e. vlek met safranine gedurende één minuut (Figuur 10)., Wanneer u de overtollige safranine verwijdert, moet u voorzichtig en kort wassen, omdat het mogelijk is om een deel van de sarfanine in de bacterie weg te spoelen.
f. droog deppen en observeren met behulp van olie-immersiemicroscopie.
3. Zorg ervoor dat u zorgvuldig giet de gebruikte kleurstof in uw kleuring lade in de afval kleurstof collectie container, niet in de gootsteen.
B., De CAPSULEVLEK
discussie
veel bacteriën scheiden een slijmerige, viskeuze bekleding af die een capsule of glycocalyx wordt genoemd . Dit is gewoonlijk samengesteld uit polysaccharide, polypeptide, of beide.
het vermogen om een capsule te produceren is een erfelijke eigenschap van het organisme, maar de capsule is geen absoluut essentiële cellulaire component. Capsules worden vaak alleen geproduceerd onder specifieke groeiomstandigheden. Hoewel niet essentieel voor het leven, capsules p robably helpen bacteriën om te overleven in de natuur., De Capsules helpen vele pathogene en normale flora bacteriën om zich aanvankelijk tegen fagocytose door fagocytic cellen van de gastheer te verzetten. In bodem en water helpen capsules te voorkomen dat bacteriën worden overspoeld door protozoën. Capsules helpen ook veel bacteriën om zich aan oppervlakken te hechten en zo spoeling te weerstaan. Het laat ook vele bacteriën toe om biofilms te vormen. Een biofilm bestaat uit lagen van bacteriële populaties die zich aan gastheercellen houden en in een gemeenschappelijke capsulaire massa worden ingebed.,
voor meer informatie over de bacteriële capsules, zie de volgende leerobjecten in uw Lecture Guide:
- The Glycocalyx (Capsule) and s-Layer; Unit 1, sectie IIB4a
- the Ability to Resist Fagocytic Engulfment; Unit 3, sectie B5b
organisme
Magere Melkbouillon cultuur van Enterobacter aerogenes. De magere melk levert essentiële voedingsstoffen voor de productie van capsules en zorgt ook voor een licht verkleinbare achtergrond.
PROCEDURE (afzonderlijk uit te voeren)
1., Roer de magere Melkbouillon cultuur met je lus en plaats 2-3 lussen Enterobacter aerogenes op een microscoopglaasje.
2. Met behulp van uw inoculerende lus, spreid het monster uit om ongeveer een centimeter van de dia te bedekken.
3. Laat het geheel aan de lucht drogen. Niet verhitten fix. Capsules plakken goed aan glas, en hitte kan de capsule vernietigen.
4. Beits één minuut met kristalviolet.
5. Was de overtollige kleurstof af met 20% kopersulfaatoplossing.
6. Schud de overtollige kopersulfaatoplossing af en dep onmiddellijk droog.
7. Observeer met behulp van olie-immersie microscopie., Het organisme en de melk die op de dia wordt gedroogd, zullen de paarse kleurstof oppakken terwijl de capsule kleurloos blijft.
8. Zorg ervoor dat u zorgvuldig giet de gebruikte kleurstof in uw kleuring lade in de afval kleurstof collectie container, niet in de gootsteen.
9. Observeer de demonstratie capsule vlek van Streptococcus lactis, een ingekapselde bacterie die normale flora in melk.
A. De Gramkleur
maak tekeningen van elke bacterie op uw Gramkleurpreparaat.,
|
|
|
| Color = Gram reaction = Shape = |
Color = Gram reaction = Shape = Arrangement = |
B., De Capsulevlek
Maak een tekening van uw capsulevlekpreparaat van Enterobacter aerogenes en de demonstratiecapsulevlek van Streptococcus pneumoniae.
Capsulevlek van
Streptococcus lactis
