ontdekking van mitochondriaal DNA
sommige concepten veroveren de wetenschappelijke wereld door storm, maar andere veroveren deze pas na vele schermutselingen. De ontdekking van mitochondriaal DNA (mtDNA) behoort tot deze tweede categorie. Biochemici, histologen en elektronenmicroscopisten hadden jarenlang DNA in mitochondriën gezien, maar de meesten van hen waren niet klaar voor het idee dat het DNA daar echt thuishoorde. Dit kan verklaren waarom de boeken van mtDNA bijna nooit vertellen hoe dit DNA werd ontdekt.,nadat het basis bouwplan van de eukaryotische cel in de vroege jaren vijftig was onthuld door de elektronenmicrografen van Palade, Sjöstrand en anderen, omarmden biochemici het dogma van de Duve dat elke macromolecule één, en slechts één, intracellulaire locatie had. In de analyse van celfracties, cytochroom oxidase werd genomen als marker voor mitochondria, nicotianamide adenine dinucleotide fosfaat (NADPH)–cytochroom C reductase voor het endoplasmatische reticulum, en DNA voor de kern., Gezien deze gemoedstoestand, is het gemakkelijk te begrijpen waarom de aanwezigheid van DNA in mitochondriale fracties over het algemeen werd toegeschreven aan besmetting door kernfragmenten. Histochemische DNA vlekken, zoals de Feulgen reactie, bevlekt ook de kinetoplasten van trypanosomen en de’ Nebenkern ‘ van insect spermatozoa, maar op dat moment was het nog niet herkend dat deze structuren in feite ongebruikelijke mitochondriën waren., Enorme hoeveelheden extranucleair DNA werden ook gedetecteerd in het cytoplasma van amfibie-oöcyten, maar het duurde vele jaren om te beseffen dat dit DNA in feite mtDNA was waarvan de overvloed de enorme hoeveelheid mitochondria in deze grote cellen weerspiegelde. In 1961, op de vijfde jaarlijkse vergadering van de American Society of Cell Biology in Chicago, toonde Hans Ris elektronenmicrografen van mitochondriën met insluitsels die op de DNA-bevattende nucleoïden van bacteriën lijken en deed het ketterse voorstel dat mitochondriën (en ook chloroplasten) hun eigen DNA bevatten., In een artikel dat in het volgende jaar verscheen, hebben Ris en Walter s Plaut deze waarnemingen verder gedocumenteerd en uitgebreid. Kort daarna bevestigden biochemische en morfologische bewijzen van verschillende groepen de aanwezigheid van DNA in chloroplasten.de ontdekking van het chloroplast-DNA deed biochemici een frisse blik werpen op de vroege bevindingen van Margaret Mitchell en Boris Ephrussi dat bepaalde mutaties die de mitochondriale functie in de schimmel Neurospora crassa en de gist Saccharomyces cerevisiae beà nvloeden, niet werden geërfd volgens de wetten van Mendel., Het leek verleidelijk om te speculeren dat de onbekende ‘extrachromosomale factoren’ betrokken bij deze mutaties in feite mtDNA waren.in 1962 was de basis voor het begrip mtDNA dus goed voorbereid, maar het begrip zelf werd niet algemeen aanvaard. Achteraf gezien, lijkt het erop dat de wetenschappelijke gemeenschap wachtte op overtuigende studies die het bestaan van mtDNA gedocumenteerd door verschillende methoden.een van deze studies kwam van de elektronenmicroscopisten Margit MK Nass en Sylvan Nass, die toen werkten aan het Wenner Gren Instituut van de Universiteit van Stockholm., Zij toonden aan dat de matrix van osmium-gefixeerde kuikenembryo mitochondriën draadachtige insluitsels bevatte waarvan de verschijning na verschillende fixatieprocedures nauw parallel liep met die van het Histon-vrije DNA-nucleoïde van bacteriën: na fixatie met osmiumtetroxide verschenen de insluitsels samengeklonterd en als staven met een diameter van ~400 Å; fixatie van de weefsels met osmiumtetroxide gevolgd door behandeling met uranylacetaat vóór dehydratie maakte ze verschijnen als 15-30-Å dunne vezels., Nog overtuigender bewijs voor de aanwezigheid van DNA in deze insluitsels was de observatie dat de insluitsels konden worden verwijderd door het licht vaste embryonale weefsel met DNase te behandelen. Behandeling met pepsine, met RNase of met DNase-vrije buffercontroles was niet effectief. De duidelijkheid van deze elektronenmicrographs en de zorgvuldige controles die werden opgenomen hadden een dwingend effect op celbiologen. MMK Nass en S Nass publiceerden hun werk in twee back-to-back papers in een 1963 nummer van het Journal of Cell Biology., Op dat moment, echter, celbiologie en biochemie waren nog vrij verschillende disciplines en de meeste biochemici niet tijdschriften gewijd aan celbiologie doorlezen. Het duurde dus even voordat de bevindingen van MMK Nass en S Nass in het bewustzijn van de biochemische gemeenschap kwamen.rond dezelfde tijd probeerden Ellen Haslbrunner, Hans Tuppy en Schatz van het biochemisch Instituut van de Universiteit van Wenen een biochemische basis te vinden voor de extrachromosomale mutaties die de ademhalingsfunctie in de gist S. cerevisiae afschaften., In de vroege jaren 1960, veel biochemici waren nog steeds terughoudend om de ‘respiratoire korrels’ van gist te beschouwen als bonafide mitochondriën, die het onderzoek door Haslbrunner et al geplaatst. ver buiten de mainstream van mitochondriale biochemie in de Verenigde Staten en elders.
om te zoeken naar DNA in mitochondriën werd gekozen voor een biochemische benadering. Gist mitochondria werden gezuiverd door de beste beschikbare methoden, en hun DNA-inhoud werd gemeten door de aloude ‘Diesche’ kleur reactie., Enkele jaren eerder hadden de Duve en collega ‘ s aangetoond dat het centrifugeren van subcellulaire fracties tot evenwicht in een dichtheidsgradiënt vaak een schone scheiding van verschillende organellen gaf. Verrassend genoeg scheidden de gebruikelijke sucrose-gradiënten gist-mitochondriën niet van kernfragmenten, maar toen sucrose werd vervangen door het röntgencontrastmiddel ‘Urografin’, vormden de mitochondriën een extreem scherpe band en was DNA in slechts twee fracties aanwezig: de meeste lagen op de bodem van de centrifugebuis en een zeer kleine hoeveelheid, maar discrete piek viel precies samen met die van de mitochondriën., Het DNA in de onderste fractie werd gemakkelijk verteerd door DNase en vertegenwoordigde blijkbaar nucleair DNA. Het DNA in de mitochondriale fractie werd niet gemakkelijk verteerd door DNase tenzij de organellen eerst werden verstoord met trichloorazijnzuur; vermoedelijk, vertegenwoordigde het DNA ingesloten door de mitochondriale membranen. De concentratie was zeer constant tussen verschillende experimenten – tussen 1 en 4 µg mg-1 mitochondriale eiwit. Urografine-gezuiverde mitochondriën uit rattenlever, rattennier en runderhart – bevatte bijna 10 keer minder DNA, tussen 0,2 en 0,6 µg DNA per mg eiwit., De typische zoogdier mitochondrion werd berekend om 3 × 10-17 g DNA te bevatten. Ervan uitgaande dat DNA double-stranded was, kon het niet meer dan 1.2 MDA van polypeptidekettingen coderen. Dit resultaat werd als belangrijk beschouwd, omdat het de mogelijkheid dat mtDNA gecodeerd alle mitochondriale eiwitten stevig uitgesloten. Vandaag, Deze vroege berekening door Haslbrunner et al. de 13 polypeptiden gecodeerd door mtDNA van zoogdieren hebben een totale massa van 0.,423 MDa, en de rest van het codeerpotentieel wordt grotendeels verklaard door genen voor ribosomal en overdracht RNAs, evenals door het feit dat mitochondria gewoonlijk meer dan één exemplaar van hun genoom van DNA hebben.
