- zapoznaj się ze specjacją rodzaju Staphylococcus.
- Rozwijaj i identyfikuj różne gatunki gronkowców za pomocą agaru selektywnego i różnicowego
- Zidentyfikuj 3 typy hemolityczne na agarze krwi.,
Staphylococcus to rodzaj Gram +, nieporuszających się cocci należących do rodziny Micrococcaceae, które często występują jako normalna ludzka mikrobiota skóry i jamy nosowej. Istnieje pięć organizmów, które można uznać za potencjalne patogeny człowieka w tym rodzaju: S. aureus, S. epidermidis, S. saprophiticus, S. haemolyticus i S. hominis, ale pierwsze trzy są najczęstszymi izolatami. S. aureus jest często uważany za najbardziej problematyczny z trzech patogenów i odróżnia się od pozostałych dwóch przez to, że jest jedynym zdolnym do koagulacji osocza. S., aureusis może powodować wiele powierzchownych zakażeń ropopochodnych (ropopochodnych) skóry właściwej i tkanek leżących u jej podłoża, a także poważne zakażenia ogólnoustrojowe. Może wytwarzać szereg toksyn, w tym enterotoksyny (zatrucie pokarmowe), cytotoksyny (ogólne toksyny ogólnoustrojowe) i superantygeny szoku toksycznego. Inne gronkowce koagulazo-ujemne (S. epidermidis i S. saprophiticus) są znacznie rzadziej spotykane jako patogeny, ale czasami są związane z zapaleniem wsierdzia, protetyczne zakażenia stawów i zakażenia ran, aby wymienić tylko kilka.,
to ćwiczenie daje możliwość użycia selektywnych mediów, w tym przypadku opartych na wysokim chlorku sodu (MSA i SM1 10 są selektywnymi mediami do izolacji gronkowców-7,5% NaCl). Środek selektywny ma czynnik hamujący, który sprzyja wzrostowi niektórych bakterii poprzez hamowanie innych. MSA zawiera dodatkowy wskaźnik do monitorowania fermentacji mannitolu, co sprawia, że jest to również środek różnicowy., Z bakterii, które mogą rosnąć w obecności wysokiego NaCl, niektóre są halofilowe (wymaga pewnego stężenia soli do wzrostu), podczas gdy inne są haloduric (nie używać soli, ale może ją tolerować). Gronkowiec nie jest halofilowy, ale raczej halodurowy, ponieważ może żyć lub znosić wysokie stężenia NaCl. Wysoka zawartość soli w SM1 10 i MSA hamuje inne typowe mikroorganizmy skóry. Inne środki używane w tym ćwiczeniu są do odróżnienia patogennych gronkowców od niepatogennych i do identyfikacji gatunku.,
nie tylko odporny na sól, gronkowiec jest zawsze fakultatywnie beztlenowy. Po zabarwieniu będzie widoczny w małych gromadach (staphylo = cluster). Staphylococcus jest zwykle albo beta hemolityczne lub nie hemolityczne w ogóle (zwany gamma hemolizy). Gronkowce chorobotwórcze mogą wytwarzać różne czynniki zjadliwości, w tym toksyny, koagulazę, leukocydyny i enzymy hydrolityczne, które mogą uszkodzić tkanki gospodarza.
Agar krwi (BAP) jest wytwarzany z 5% krwi owiec. Jest to powszechne medium używane do hodowli bakterii, ponieważ:
- jest to świetne medium wzbogacające dla wybrednych bakterii.,
- hemoliza komórek krwi może być bardzo przydatna jako test identyfikacyjny.
CNA agar jest rodzajem agaru krwi. Jedyną różnicą jest to, że CNA ma antybiotyk, kwas naladiksowy, który hamuje gram-bakterie.
hemoliza to rozpad czerwonych krwinek. Hemolizyny są enzymami wytwarzanymi przez niektóre bakterie i są uwalniane do środowiska wokół Kolonii bakteryjnej. Może to być kompletny podział komórek, z uwalnianiem hemoglobiny i oczyszczaniem czerwieni z otaczającego ośrodka wokół Kolonii., Lub hemoliza może być częściowym rozpadem, co powoduje zielonkawą lub zielono-żółtą strefę wokół Kolonii.,i>
schemat procedury identyfikacji
1.sesja od ⇒ 2. sesja od ⇒ 3. sesja od ⇒ 4. sesja
MSA sm110 onpg
oksydaza katalazowa
gram fenolowa laktoza
bulion plamisty
procedury
uwaga
pamiętaj, aby zachować listę wszystkich wyników testów dla izolatów.,
i sesja
- w każdej tabeli zostaną podane gronkowce rosnące na płytce aNA lub TSA.
- stosując technikę izolacji zaszczepić kwas Columbia naladiksowy (CNA) i umieścić dysk nowobiocynowy w sekcji 1.
- wrażliwość na Nowobiocynę jest kluczową cechą odróżniającą niektóre gatunki gronkowców. Umieść kleszcze w alkoholu, a następnie wysterylizuj kleszcze, szybko przepuszczając je przez płomień. Alkohol zapali się, a po wyparowaniu z kleszczy, będzie sterylny., Można teraz wybrać dysk novobiocin z uchwytu, aby umieścić na płytce CNA-w pierwszej sekcji pasmowej—gdzie nastąpi rozrost bakterii).
- dla innych płyt agarowych-Płyta SM 110, Płyta agaru z solą mannitolową( MSA), Płyta agaru DNAse—linia szczepienia w dół środka płyty jest odpowiednia dla wyników wzrostu.
- inkubować media w temperaturze 37°C.
- przeprowadzić testy oksydazy i katalazy na kulturze płytkowej.
- Gram zabarwia izolat, aby uzyskać kształt i układ, a także reakcję grama.
- w następnej sesji wykonamy test ONPG., Ten test wymaga włączenia zestawu genów, lac operon. Aby wywołać tę aktywność, bakteria musi być narażona na laktozę. Dlatego będziesz również zaszczepić tubkę bulionu laktozy Czerwieni fenolowej.
II sesja
- przejdź do indywidualnych ćwiczeń laboratoryjnych, aby zinterpretować test soli mannitolu i DNazy (wymaga HCl).
- na płytce CNA sprawdzasz 2 reakcje – – – wrażliwość na antybiotyk nowobiocyny i hemolizę krwi.,
- czułość Nowobiocyny – Strefa 17 mm wskazuje czułość
- reakcje hemolityczne :
- hemoliza Alfa (α)–zielona strefa wokół Kolonii, spowodowana wyciekiem hemoglobiny przekształconej w biliverdin, zwana częściową hemolizą
- hemoliza Beta (β)–całkowite oczyszczenie wokół Kolonii spowodowane rozpadem hemoglobiny.RBC przez enzymy streptolysin
- gamma (γ) hemoliza – brak hemolizy, Brak strefy
- gatunki Staphylococcus są albo beta hemolityczne lub Gamma (nie hemolityczne)., Gronkowiec złocisty produkuje toksyny alfa, które zazwyczaj powoduje szerokie strefy Beta (kompletne) hemolizy.
- Sprawdź SM 110 pod kątem wzrostu i pigmentu. Składniki odżywcze i witaminy w tym medium wzmacniają pigmentację patogennego gronkowca, kolonie te stają się kolonią żółto-pomarańczową.
- Uruchom test koagulazy: istnieje powiązane ćwiczenie dla tego testu. Istnieje tylko kilka gatunków gronkowców, które są pozytywne dla testu koagulazy( patrz tabela poniżej), A S. aureus jest najczęstszym., Ponieważ istnieją 2 rodzaje koagulazy związanej z enzymem i wolnej – – – istnieją 2 różne testy, które można wykorzystać do identyfikacji tych enzymów. Metoda rurowa jest ostatecznym testem 2, najbardziej niezawodnym. Ćwiczenie testu koagulazy w podręczniku laboratoryjnym wyraźnie opisuje te 2 wersje.
- test ONPG zostanie uruchomiony. Poszukaj w swoich ćwiczeniach laboratoryjnych tego testu wskazówek, jak uruchomić test. Ponieważ w tubie jest bardzo mało cieczy, będziesz chciał pokryć górną część tuby parafilm, a następnie umieścić górną rurkę nad tym. Zmniejsza to odwodnienie.,
3 sesja
- główną reakcją testową stosowaną w identyfikacji gronkowców jest reakcja testu koagulazy, która dzieli rodzaj Staphylococcus na 2 grupy—gatunki koagulazo-ujemne i gatunki koagulazo-dodatnie. Media testowe, które zostaną uruchomione w celu identyfikacji, zależą od kategorii, do której należy twój organizm. Możesz uruchomić niektóre z poniższych testów.,
- Available media:
- arginine and ornithine
- decarboxylase broths
- urea broth
- ONPG
- sucrose, trehalose, maltose sugars
- VP broth
- nitrate broth
- If you have a coagulase positive Staph, there are only a few species available as your choice: there is a table with those species below.,
- Jeśli Twoje organizmy są ujemne, sprawdź poniższy schemat blokowy, a także podręcznik Bergey ' a lub inne książki identyfikacyjne.
- Uruchom niezbędne testy do identyfikacji. DO CIEBIE NALEŻY OKREŚLENIE DODATKOWYCH TESTÓW, KTÓRE NALEŻY PRZEPROWADZIĆ W CELU JEDNOZNACZNEJ IDENTYFIKACJI.
4.sesja
- Przeczytaj wszystkie testy z ostatniej sesji (Zobacz ćwiczenia laboratoryjne, aby uzyskać informacje na temat interpretacji testu.
- napisz raport do identyfikacji gatunku gronkowca, jeśli instruktor poleci ci to zrobić.,
| Tube coagulase | Acid from trehalose | VP test | ONPG test | |
| S. aureus | + | + | + | – |
| S. intermedius | + | + | – | + |
| S., hyicus | variable | + | – | – |
| S. schleiferi | + | – | + | ? |
Common coagulase negative Staphylococcal species
| S. aureus | S. epidermidis | S. saprophiticus | |
| Alpha toxin (ß-hemolysis) | + (most strains) | – | – |
| Growth on 7.,acace93570″>DNase production | + (usually) | – | – |
| Sensitivity to novobiocin | sensitive | sensitive | resistant |
* Novobiocin sensitivity = >17mm zone size
QUESTIONS
- Which type of hemolysis is often associated with pathogenicity?,
- jakie są cechy wyróżniające Rodzaj Staphylococcus?
- czy możesz podać reakcję testową S. aureusa dla każdego z głównych testów—MSA, SM110, koagulazy, katalazy, oksydazy i DNazy?
- co się dzieje z Rbc w hemolizie beta i Alfa?
autorzy i atrybuty
-
Jackie Reynolds, profesor biologii (Richland College)
