diagnostyka laboratoryjna hemoglobinopatii
podstawowe badanie hemoglobinopatii powinno obejmować pełną morfologię krwi, film krwi obwodowej i elektroforezę hemoglobiny (patrz Rys. 29.4). Pełna morfologia krwi umożliwia ocenę tworzenia się hemoglobiny, ocenianą na podstawie wskaźników krwinek czerwonych, średniej objętości komórek (MCV) i średniego stężenia hemoglobiny (MCH)., Mikrocytoza (MCV < 76 fL) i hipochromia (MCH < 27 pg), w obliczu prawidłowej lub podwyższonej liczby czerwonych krwinek (> 5,5 × 1012/L) u pacjenta z niedoborem żelaza, sugerują diagnozę talasemii. W przypadku talasemii dużej lub Intermedialnej wiąże się to ze znacznym stopniem niedokrwistości, podczas gdy w talasemii cecha hemoglobiny jest zwykle prawidłowa lub tylko nieznacznie zmniejszona. W potwierdzeniu rozpoznania pomocne może być badanie zabarwionego filmu krwi metodą Giemsa., Jednak ostateczne rozpoznanie często opiera się na analizie elektroforetycznej lub chromatograficznej hemoglobiny w hemolizatach czerwonokrwinkowych. Elektroforeza octanu celulozy przy pH zasadowym (8,9-9,1) jest najczęściej stosowaną metodą, jest prosta, szybka, niedroga i skuteczna w oddzielaniu wspólnych wariantów hemoglobiny. W homozygotycznej niedokrwistości sierpowatokrwinkowej dominuje HbS. Występuje zmienna ilość HbF, wyższe proporcje (> 10%) są zazwyczaj związane z łagodniejszym przebiegiem klinicznym. Stężenie hemoglobiny A2 jest zwykle prawidłowe.,
badanie rozpuszczalności oparte na zmniejszonej rozpuszczalności deoksy-HbS w obecności środków redukujących, na przykład ditionitu sodu, ma ograniczoną rolę w diagnostyce choroby sierpowatej, ponieważ nie różnicuje choroby homozygotycznej i stanów nośnych. W sytuacji awaryjnej pozytywny test rozpuszczalności w połączeniu ze znacznie zmniejszoną hemoglobiną i typową morfologią krwinek czerwonych wskazuje silnie na diagnozę niedokrwistości sierpowatokrwinkowej. Należy to potwierdzić przy najbliższej okazji analizą stężenia hemoglobiny., Kilka innych wariantów, w tym HbD, HBG i HB Lepore, ma mobilność elektroforetyczną identyczną jak w przypadku HBS na octanie celulozy, ale można je odróżnić za pomocą ujemnego testu rozpuszczalności sierpa i elektroforezy z agaru cytrynianowego przy kwaśnym pH (6.0). Podobnie hemoglobiny C, E I O, które współmigrują z octanem celulozy przy pH zasadowym, można różnicować za pomocą elektroforezy agaru cytrynianowego. Zarówno HBE, jak i Hb Lepore są związane z talasemicznymi wskaźnikami krwinek czerwonych, co dodatkowo ułatwia ich odróżnienie od elektroforetycznie podobnych wariantów., Ogniskowanie izoelektryczne poprawia rozdzielczość niektórych wariantów strukturalnych i może być również stosowane do badań przesiewowych noworodków eluatów z kart Guthrie (dried blood spot), ponieważ zmniejsza interferencję z methemoglobiny obecnej w takich próbkach.
Wysokosprawna chromatografia cieczowa (HPLC) jest szybką i czułą metodą rozdzielania i ilościowania hemoglobin, która w niektórych przypadkach pozwala na identyfikację wariantów niemożliwych przy użyciu innych technik., Ponieważ jest on w dużej mierze zautomatyzowany i wymaga niewielkich ilości próbek, HPLC stał się metodą wyboru dla badań populacyjnych na dużą skalę, takich jak programy przesiewowe noworodków. Powszechne badania przesiewowe noworodków w kierunku niedokrwistości sierpowatokrwinkowej są od pewnego czasu stosowane w USA i Anglii, a podobne programy są wprowadzane do innych krajów Europy, Bliskiego Wschodu i Afryki, w zależności od częstości występowania warunków i dostępnych zasobów., Programy te przyniosły znaczące korzyści w postaci zmniejszenia śmiertelności i zachorowalności dzięki lepszej opiece, wczesnemu wdrożeniu profilaktyki przeciw zakażeniom pneumokokowym i edukacji rodziców. W talasemii β odsetek poszczególnych hemoglobin różni się w zależności od genotypu. Talasemia homozygotyczna β0 jest związana z przewagą HbF, brakiem HbA i zmiennymi ilościami HbA2 (zakres 1,0–6,0%, średnio 1,7%). U osób z homozygotyczną β+ talasemią lub złożoną heterozygotyczną β0 / β+ talasemią występuje zmienna ilość HbA., Stężenie hemoglobiny F jest zwiększone i dystrybuowane niejednorodnie wśród krwinek czerwonych.
dokładna ilość HbA2 za pomocą chromatografii HPLC lub mikrokolumn jest niezbędna do rozpoznania cechy β talasemii, w której hba2 jest podwyższony, zazwyczaj> 3,5%., Nosiciele „normalnej A2” lub „cichej” talasemii β z powodu łagodnych wad genu β lub współwystępowania mutacji genu δ w cis lub trans nie mogą być łatwo odróżnieni od talasemii α za pomocą konwencjonalnych metod przesiewowych i wymagają badań za pomocą specjalistycznych technik, w tym syntezy łańcucha globin in vitro i analizy DNA. Analiza globin łańcuch syntetycznych współczynników tritiated leucyny inkorporacji i karboksymetylocelulozy chromatografii jest ostateczny sposób identyfikacji osób z talasemią, choć rzadko jest stosowany ze względu na jego pracochłonny charakter.,
α thalassaemias charakteryzują się obecnością szybko poruszających się wariantów, HBH (γ4) i HBH (β4), które są najbardziej widoczne w próbkach noworodków. W hydrops fetalis z powodu homozygotycznej talasemii α0 dominuje Hb Bart i występuje w mniejszych ilościach w innych zespołach talasemii α w okresie noworodkowym. Hemoglobina H może być również wykrywana przez barwienie ciał włączających HbH., Diagnoza klinicznie cichych postaci talasemii α jest często wykluczająca, dokonywana na podstawie pochodzenia etnicznego podmiotu, mikrocytowych wskaźników hipochromicznych krwinek czerwonych oraz normalnego lub niskiego stężenia HbA2 w obecności prawidłowego stanu żelaza. Ostateczną diagnozę można postawić na podstawie analizy DNA, w której często można wyróżnić talasemię α0 i α+.,
podczas gdy większość hemoglobinopatii można zdiagnozować za pomocą elektroforezy hemoglobiny, warianty spowodowane substytucjami aminokwasów, które nie zmieniają ładunku, takie jak te Znalezione w niektórych niestabilnych hemoglobinach lub hemoglobinach ze zmienionym powinowactwem tlenowym, mogą uniknąć wykrycia. Dalsze badania, które mogą być pomocne w tym kontekście, obejmują ocenę niestabilności hemoglobiny i powinowactwa tlenowego., Wysoka przepustowość analiza DNA uczyniła to wykonalnym sposobem przesiewania mutacji globiny w bogatszych krajach, z technikami takimi jak multipleks ligation-dependent Amplification sondy pozwalającymi identyfikację dużych mutacji genów, które były wcześniej wykrywalne tylko przy użyciu Southern blotting. Spektrometria masy hemoglobiny może być również stosowana do identyfikacji nieprawidłowych globin poprzez dokładny pomiar ich masy, ze szczególnym potencjalnym zastosowaniem w programach przesiewowych, które już wykorzystują spektrometrię mas.,
identyfikacja par zagrożonych poważnymi hemoglobinopatiami za pomocą badań przedporodowych lub przedporodowych pozwala na świadomy wybór reprodukcyjny z opcją diagnozy prenatalnej. W większości przypadków można to osiągnąć w pierwszym trymestrze ciąży, wykrywając zmutowane geny globiny w kosmówkowym DNA kosmówkowym. W kilku krajach, zwłaszcza na Cyprze, gdzie współczynnik nośności talasemii β sięga 12%, doprowadziło to do znacznego spadku częstości występowania zaburzeń związanych z hemoglobiną., Diagnoza genetyczna przedimplantacyjna jest coraz częściej stosowana, aby umożliwić selekcję nienaruszonych zarodków, chociaż nadal jest to wymagający i kosztowny proces, który nie ma zastosowania do większości par. Próby rozwoju nieinwazyjnej diagnostyki prenatalnej z wykorzystaniem komórek płodu i DNA we krwi matki, choć obecnie nie jest to technicznie wykonalne jako rutynowa procedura dotycząca hemoglobinopatii.
