dyskusja
plamy Gram są najczęściej stosowanym zabiegiem barwienia w bakteriologii. Nazywa się ją różniczkowalną plamą, ponieważ różnicuje bakterie Gram-dodatnie i Gram-ujemne. Bakterie, które plamią się na fioletowo metodą barwienia grama, są określane jako Gram-dodatnie; te, które plamią się na różowo, są uważane za Gram-ujemne. Pojęcia dodatnie i ujemne nie mają nic wspólnego z ładunkiem elektrycznym, ale po prostu wyznaczają dwie odrębne grupy morfologiczne bakterii.,
bakterie Gram-dodatnie i Gram-ujemne zabarwiają się inaczej ze względu na fundamentalne różnice w strukturze ich ścian komórkowych. Ściana komórkowa bakterii służy do nadania organizmowi jego wielkości i kształtu, a także do zapobiegania lizy osmotycznej. Materiałem w ścianie komórkowej bakterii nadającym sztywność jest peptydoglikan.
w mikrografach elektronowych Gram-dodatnia ściana komórkowa pojawia się jako szeroka, gęsta ściana o grubości 20-80 nm i składa się z wielu łączących się warstw peptydoglikanu (rysunki 1A i 1B). Chemicznie, 60 do 90% Gram-dodatniej ściany komórkowej jest peptydoglikan., W ścianie komórkowej Gram-dodatnich przeplatają się kwasy teichoic. Kwasy Teichoic, które rozciągają się przez i poza resztę ściany komórkowej, składają się z polimerów glicerolu, fosforanów i alkoholu cukrowego ribitolu. Niektóre mają przyłączony lipid (kwas lipoteichoic). Zewnętrzna powierzchnia peptydoglikanu jest nabijana białkami, które różnią się szczepem i gatunkami bakterii.,
z drugiej strony Gram-ujemna ściana komórkowa zawiera tylko 2-3 warstwy peptydoglikanu i jest otoczona zewnętrzną błoną złożoną z fosfolipidów, lipopolisacharydów, lipoprotein i białek (ryc. 2a i 2b). Tylko 10% – 20% Gram-ujemnej ściany komórkowej to peptydoglikan. Fosfolipidy znajdują się głównie w wewnętrznej warstwie błony zewnętrznej, podobnie jak lipoproteiny, które łączą błonę zewnętrzną z peptydoglikanem., Lipopolisacharydy, znajduje się w zewnętrznej warstwie błony zewnętrznej, składa się z części lipidowej o nazwie lipid a osadzonej w błonie i części polisacharydowej rozciągającej się na zewnątrz od powierzchni bakterii. Błona zewnętrzna zawiera również szereg białek, które różnią się szczepem i gatunkami bakterii.,
aby uzyskać więcej informacji na temat Gram-ujemnej i Gram-dodatniej ściany komórkowej, zapoznaj się z następującymi przedmiotami edukacyjnymi w swoim przewodniku:
- ściana komórkowa Prokariotyczna; Jednostka 1, Sekcja IIB2
- ściana komórkowa Gram-ujemna; Jednostka 1, Sekcja IIB2b
procedura barwienia metodą Grama obejmuje cztery podstawowe kroki:
1. Bakterie są najpierw barwione podstawowym barwnikiem fiolet krystaliczny. Zarówno bakterie Gram-dodatnie, jak i Gram-ujemne stają się bezpośrednio zabarwione i po tym etapie wydają się fioletowe.,
2. Bakterie są następnie traktowane z roztworu jodu grama. Pozwala to lepiej zatrzymać plamę, tworząc nierozpuszczalny krystaliczny kompleks fioletowo-jodowy. Zarówno bakterie Gram-dodatnie, jak i Gram-ujemne pozostają fioletowe po tym etapie.
3. Następnie dodaje się odbarwiacz grama, mieszaninę alkoholu etylowego i acetonu. Jest to stopień różnicowy. Bakterie Gram-dodatnie zachowują krystaliczny kompleks fioletowo-jodowy, podczas gdy Gram-ujemne są odbarwiane.
4. W końcu stosuje się safraninę przeciwstarzeniową (również podstawowy barwnik)., Ponieważ bakterie Gram-dodatnie są już zabarwione na fioletowo, nie mają wpływu na kontr. Bakterie Gram-ujemne, które są teraz bezbarwne, zostają bezpośrednio zabarwione przez safraninę. Tak więc Gram-dodatnie wydają się fioletowe, a Gram-ujemne różowe.
© Daniel Cavanaugh, Mark Keen, autorzy, Licensed for use, ASM MicrobeLibrary.,
przy obecnej teorii barwienia grama uważa się, że w bakteriach Gram-dodatnich fiolet krystaliczny i jod łączą się, tworząc większą cząsteczkę, która wytrąca się w komórce. Mieszanina alkoholu / acetonu powoduje następnie odwodnienie wielowarstwowego peptydoglikanu, zmniejszając w ten sposób przestrzeń między cząsteczkami i powodując, że ściana komórkowa zatrzymuje krystaliczny kompleks fioletowo-jodowy w komórce., W przypadku bakterii Gram-ujemnych mieszanina alkoholu/acetonu, będąca rozpuszczalnikiem lipidowym, rozpuszcza zewnętrzną błonę ściany komórkowej i może również uszkodzić błonę cytoplazmatyczną, do której przyłączony jest peptydoglikan. Kilka warstw peptydoglikanu nie jest w stanie zatrzymać krystalicznego kompleksu fioletowo-jodowego, a komórka jest odbarwiona.
należy zauważyć, że Gram-dodatni (zdolność do zachowania kompleksu fioletowo-krystalicznego fioletu-jodu) nie jest zjawiskiem wszystko albo nic, ale kwestią stopnia., Istnieje kilka czynników, które mogą spowodować zabarwienie Gram-dodatnie organizmu Gram-ujemnie:
1. Zastosowaną metodę i techniki. Przegrzanie podczas utrwalania ciepła, nadmierna odbarwianie alkoholem, a nawet nadmierne mycie wodą między etapami może spowodować utratę przez bakterie Gram-dodatnie kompleksu fioletowo-jodowego.
2. Wiek Kultury. Kultury starsze niż 24 godziny mogą utracić zdolność do zatrzymywania krystalicznego kompleksu fiołkowo-jodowego.
3. Sam organizm., Niektóre bakterie Gram-dodatnie są bardziej zdolne do zatrzymania krystalicznego kompleksu fiołkowo-jodowego niż inne.
dlatego należy stosować bardzo precyzyjne techniki barwienia gramów i interpretować wyniki z dyskrecją.
Trypticase soy agar plate cultures of Escherichia coli (a small, Gram-negative bacillus) and Staphylococcus epidermidis (a gram-dodatni coccus with a staphylococcus arrangement).
procedura (do wykonania indywidualnie)
1., Escherichia coli
a. rozgrzać wymaz Escherichia coli w następujący sposób:
1. Używając butelki z kroplomierzem dejonizowanej wody znajdującej się w stojaku do barwienia, umieść 1/2 normalnej wielkości kropli wody na czystym szkiełku, dotykając zakraplacza do szkiełka (Rysunek 1). Następnie użyj sterylizowanej pętli zaszczepiającej, aby umieścić kroplę dejonizowanej wody na zjeżdżalni.
2., Używając sterylnej pętli inokulacyjnej, aseptycznie Usuń niewielką ilość posiewu z powierzchni agaru i delikatnie dotknij go 2 – 3 razy do kropli wody, aż woda stanie się wyraźnie mętna (ryc. 2). Dobry rozmaz z odpowiednią ilością bakterii jest niezbędny do barwienia grama.
- zbyt duża liczba bakterii na szkiełku może spowodować niedostateczną odbarwianie; zbyt mała liczba może prowadzić do nadmiernej odbarwiania.
3. Spalić pozostałe bakterie w pętli inokulacyjnej., Jeśli do wody zostanie dodana zbyt duża ilość kultury, nie zobaczysz poplamionych pojedynczych bakterii i możesz nie mieć wiarygodnej plamy gramowej.
4. Po ostygnięciu pętli inokulacyjnej rozprowadzić zawiesinę na około połowie szkiełka, tworząc cienką warstwę. Prawidłowo przygotowany rozmaz z odpowiednią ilością bakterii powinien wyglądać podobnie do rys. 3.
5. Pozostawić tę cienką zawiesinę do całkowitego wyschnięcia na powietrzu (rys. 4). Rozmaz musi być całkowicie suchy przed zamocowaniem szkiełka na gorąco!
6., Aby podgrzać bakterie do zjeżdżalni, podnieś wysuszoną powietrzem zjeżdżalnię za pomocą szczypiec coverslip i przytrzymaj dno zjeżdżalni naprzeciwko rozmazu w pobliżu otworu mikroincyneratora przez 10 sekund (Rysunek 5), Jak pokazał instruktor. Jeśli szkiełko nie jest wystarczająco podgrzane, wszystkie bakterie zmyją się. Jeśli jest przegrzany, integralność strukturalna bakterii może zostać uszkodzona.
b. bejcowanie fioletem krystalicznym Huckera przez jedną minutę (ryc. 6). Delikatnie przemyć wodą (ryc. 7). Wytrząśnij nadmiar wody, ale nie wysuszaj między stopniami.
c., Bejcuj roztworem jodu grama przez minutę (ryc. 8) i delikatnie umyj wodą.
D. odbarwiać, podnosząc suwak i pozwalając odbarwiaczowi grama biegać po suwaku, aż fioletowy przestanie płynąć na dole suwaka (ryc. 9).
- upewnij się, że cały rozmaz jest równomiernie odbarwiony i że nie odbarwiasz ani nie odbarwiasz.
- natychmiast przemyć wodą.
e. plamić safraniną przez jedną minutę (ryc. 10)., Kiedy zmywa się nadmiar safraniny, należy bardzo uważać, aby umyć ją delikatnie i krótko, ponieważ możliwe jest wypłukanie części sarfaniny z bakterii.
f. zaschnąć (ryc. 11) i obserwować za pomocą mikroskopii zanurzeniowej oleju.
2. Staphylococcus epidermidis
a. Heat-fix rozmaz Staphylococcus epidermidis w następujący sposób:
1. Używając butelki z kroplomierzem dejonizowanej wody znajdującej się w stojaku do barwienia, umieść 1/2 normalnej wielkości kropli wody na czystym szkiełku, dotykając zakraplacza do szkiełka (Rysunek 1)., Następnie użyj sterylizowanej pętli zaszczepiającej, aby umieścić kroplę dejonizowanej wody na zjeżdżalni.
2. Używając sterylnej pętli inokulacyjnej, aseptycznie Usuń niewielką ilość posiewu z powierzchni agaru i delikatnie dotknij go 2 – 3 razy do kropli wody, aż woda stanie się wyraźnie mętna (ryc. 2).
- zbyt duża liczba bakterii na szkiełku może spowodować niedostateczną odbarwianie; zbyt mała liczba może prowadzić do nadmiernej odbarwiania.
3. Spalić pozostałe bakterie w pętli inokulacyjnej., Jeśli do wody zostanie dodana zbyt duża ilość kultury, nie zobaczysz poplamionych pojedynczych bakterii i możesz nie mieć wiarygodnej plamy gramowej.
4. Po ostygnięciu pętli zaszczepiającej rozprowadzić zawiesinę na około połowie szkiełka, tworząc cienką warstwę (ryc. 3).
5. Pozostawić tę cienką zawiesinę do całkowitego wyschnięcia na powietrzu (rys. 4). Rozmaz musi być całkowicie suchy przed zamocowaniem szkiełka na gorąco!
6., Aby podgrzać bakterie do zjeżdżalni, podnieś wysuszoną powietrzem zjeżdżalnię za pomocą szczypiec coverslip i przytrzymaj dno zjeżdżalni naprzeciwko rozmazu w pobliżu otworu mikroincyneratora przez 10 sekund (Rysunek 5), Jak pokazał instruktor. Jeśli szkiełko nie jest wystarczająco podgrzane, wszystkie bakterie zmyją się. Jeśli jest przegrzany, integralność strukturalna bakterii może zostać uszkodzona.
b. bejcowanie fioletem krystalicznym Huckera przez jedną minutę (ryc. 6). Delikatnie przemyć wodą (ryc. 7). Wytrząśnij nadmiar wody, ale nie wysuszaj między stopniami.
c., Bejcuj roztworem jodu grama przez minutę (ryc. 8) i delikatnie umyj wodą.
D. odbarwiać, podnosząc suwak i pozwalając odbarwiaczowi grama biegać po suwaku, aż fioletowy przestanie płynąć na dole suwaka (ryc. 9).
- upewnij się, że cały rozmaz jest równomiernie odbarwiony i że nie odbarwiasz ani nie odbarwiasz.
- natychmiast przemyć wodą.
e. plamić safraniną przez jedną minutę (ryc. 10)., Kiedy zmywa się nadmiar safraniny, należy bardzo uważać, aby umyć ją delikatnie i krótko, ponieważ możliwe jest wypłukanie części sarfaniny z bakterii.
F. osuszyć i obserwować za pomocą mikroskopii zanurzeniowej oleju.
3. Upewnij się, że ostrożnie wlej zużyty barwnik do tacy do barwienia do pojemnika do zbierania barwników odpadowych, a nie do zlewu.
© Hussein Shoeb, autor. Licencjonowany do użytku, MicrobeLibrary ASM.
B., Plama w kapsułce
wiele bakterii wydziela śluzowatą, lepką powłokę zwaną kapsułką lub glikokaliksem . Zwykle składa się z polisacharydu, polipeptydu lub obu.
zdolność do wytwarzania kapsułki jest dziedziczną właściwością organizmu, ale kapsułka nie jest absolutnie niezbędnym składnikiem komórkowym. Kapsułki są często produkowane tylko w określonych warunkach wzrostu. Nawet jeśli nie są niezbędne do życia, kapsułki P niezawodnie pomagają bakteriom przetrwać w przyrodzie., Kapsułki pomagają wielu chorobotwórczym i normalnym bakteriom flory początkowo oprzeć się fagocytozie przez komórki fagocytarne gospodarza. W glebie i wodzie kapsułki zapobiegają pochłanianiu bakterii przez pierwotniaki. Kapsułki pomagają również wielu bakteriom przylegać do powierzchni, a tym samym zapobiegają płukaniu. Umożliwia również wielu bakteriom tworzenie biofilmów. Biofilm składa się z warstw populacji bakterii przylegających do komórek gospodarza i osadzonych we wspólnej masie torebki.,
aby uzyskać więcej informacji na temat kapsułek bakteryjnych, zapoznaj się z następującymi przedmiotami edukacyjnymi w Przewodniku wykładowym:
- Glycocalyx (kapsułka) i warstwa S; Jednostka 1, Sekcja IIB4a
- zdolność do odporności na pochłonięcie fagocytarne; Jednostka 3, Sekcja B5b
hodowla bulionów z odtłuszczonego mleka Enterobacter aerogenes. Odtłuszczone mleko dostarcza niezbędnych składników odżywczych do produkcji kapsułek, a także zapewnia lekko plamiste tło.
procedura (do wykonania indywidualnie)
1., Wymieszać chudą hodowlę bulionu mlecznego za pomocą pętli i umieścić 2-3 pętle Enterobacter aerogenes na szkiełku mikroskopowym.
2. Za pomocą pętli inokulacyjnej rozłóż próbkę, aby pokryć około jednego cala slajdu.
3. Pozostawić do całkowitego wyschnięcia na powietrzu. Nie naprawiaj ciepła. Kapsułki dobrze przylegają do szkła, a ciepło może zniszczyć kapsułkę.
4. Plam fioletem krystalicznym przez minutę.
5. Zmyć nadmiar barwnika 20% roztworem siarczanu miedzi.
6. Wytrząsnąć nadmiar roztworu siarczanu miedzi i natychmiast osuszyć.
7. Obserwuj za pomocą mikroskopii zanurzeniowej oleju., Organizm i mleko wysuszone na szkiełku odbierze Fioletowy barwnik, podczas gdy kapsułka pozostanie bezbarwna.
8. Upewnij się, że ostrożnie wlej zużyty barwnik do tacy do barwienia do pojemnika do zbierania barwników odpadowych, a nie do zlewu.
9. Obserwuj plamę w kapsułkach demonstracyjnych Streptococcus lactis, zamkniętej bakterii, która jest normalną florą w mleku.
A. plama grama
wykonaj rysunki każdej bakterii na swoim preparacie plamy grama.,
|
|
|
| Color = Gram reaction = Shape = |
Color = Gram reaction = Shape = Arrangement = |
B., Plama w kapsułkach
wykonaj rysunek preparatu do plam w kapsułkach Enterobacter aerogenes i demonstracyjnej plamy w kapsułkach Streptococcus pneumoniae.
plama kapsułkowa
Streptococcus lactis
