potrzeba prawdziwego wysiłku, aby Twoja podstawowa wiedza o biologii molekularnej i komórkowej była świeża, oprócz wszystkiego, co musisz zrobić. Czy nie byłoby wspaniale, gdyby istniało miejsce, w którym można znaleźć łatwe do odczytania artykuły, które pozwalają odświeżyć te podstawy w zaledwie kilka minut?
…mam nadzieję, że odpowiedziałeś „tak”, bo taki jest cel mojej serii artykułów „podstawy:”, którą od czasu do czasu przynosimy wam. Ten artykuł wyjaśnia podstawy ligacji DNA.,
twój kumpel z ligacji DNA: Ligaza DNA
ligaza DNA (EC 6.5.1.1) jest enzymem w sercu reakcji ligacji DNA. Kowalencyjnie łączy szkielet fosforanowy DNA z tępymi lub zgodnymi kohezyjnymi końcami (patrz rysunek 1), a jego naturalną rolą jest naprawa podwójnych przerw w cząsteczkach DNA. W biologii molekularnej jest powszechnie stosowany do wstawiania fragmentów DNA generowanych przez enzym restrykcyjny do wektorowych kości grzbietowych. Ligazy komercyjne są dostarczane z buforem reakcyjnym zawierającym ATP i Mg2+, które są niezbędne dla aktywności ligazy., Ponieważ ATP może być uszkodzony przez powtarzające się cykle zamrażania-rozmrażania, wskazane jest, aby aliquots bufora (patrz mój artykuł „5 końcówek ligacji DNA”).
Rysunek 1. Spoiste i tępe końce, gotowe do podwiązania DNA!
dwa etapy reakcji ligacji DNA
sama reakcja ligacji DNA ma dwa podstawowe etapy. Po pierwsze końce DNA muszą zderzyć się przypadkowo i pozostać razem na tyle długo, aby ligaza do nich dołączyła. Jest to najbardziej nieefektywna część reakcji, ale jest łatwiejsza w niskich temperaturach. Dlaczego?, Cóż, jak zapewne wiesz, wszystkie cząsteczki poruszają się szybciej w wyższych temperaturach, więc możesz sobie wyobrazić, że łatwiej będzie dwóm końcom DNA zderzyć się i pozostać razem, jeśli delikatnie unoszą się przez roztwór w niskiej temperaturze, a nie wirują jak w wyższych temperaturach. Dla spójnych końców istnieje dodatkowy powód; niższe temperatury stabilizują wiązanie wodorowe między komplementarnymi nukleotydami, co naprawdę pomaga utrzymać rzeczy na swoim miejscu.
Rysunek 2., Enzymatyczna reakcja ligacji DNA
drugi etap to reakcja enzymatyczna, pokazana schematycznie na rysunku 2.. Ligaza DNA katalizuje połączenie 3′-OH z 5 ' – fosforanem za pomocą mechanizmu dwustopniowego. Po pierwsze, nukleotyd AMP, który jest przyłączony do pozostałości lizyny w miejscu aktywnym enzymu, jest przenoszony do 5′-fosforanu. Następnie Wiązanie AMP-fosforan jest atakowane przez 3 ' – OH, tworząc wiązanie kowalencyjne i uwalniając AMP. Aby enzym mógł prowadzić dalsze reakcje, AMP w miejscu aktywnym enzymu musi być uzupełniany przez ATP.,
oto dlaczego Przeprowadzanie ligacji DNA w niskich temperaturach może pomóc
enzym ligazy DNA ma optymalną aktywność w temperaturze 25°C, więc reakcja ligacji odbywa się w temperaturze, która jest kompromisem między optymalnymi temperaturami do łączenia końcówek DNA (1°C) a reakcją enzymatyczną (25°C). Zwykle 1 godz w 16°C jest w porządku, ale ponieważ łączenie końcówek DNA jest najmniej efektywną częścią reakcji, sprzyjając temu przez obniżenie temperatury do 4°C, może dać jeszcze większą wydajność. Jednak enzym będzie działał bardzo wolno w tej temperaturze tak długo (np., noc) czas inkubacji jest wymagany.
czy to ci pomogło? Następnie podziel się z siecią.
