odkrycie mitochondrialnego DNA
niektóre koncepcje burzą świat nauki, ale inne podbijają go dopiero po wielu potyczkach. Odkrycie mitochondrialnego DNA (mtDNA) należy do tej drugiej kategorii. Biochemicy, histolodzy i mikroskopie elektronowe widzieli DNA w mitochondriach przez lata, ale większość z nich nie była gotowa na pomysł, że DNA naprawdę tam należy. To może wyjaśniać, dlaczego podręcznikowe relacje mtDNA prawie nigdy nie mówią, jak to DNA zostało odkryte.,
Po tym, jak podstawowy plan budowy komórki eukariotycznej został ujawniony we wczesnych latach 50.przez mikrofrografy elektronowe Palade 'a, Sjöstranda i innych, biochemicy przyjęli dogmat de Duve' a, że każda makrocząsteczka ma jedną i tylko jedną wewnątrzkomórkową lokalizację. W analizie frakcji komórkowych oksydazę cytochromu przyjęto jako marker dla mitochondriów, fosforan dinukleotydu nikotyanamidowo-adeninowego (NADPH) – reduktazę cytochromu c dla retikulum endoplazmatycznego oraz DNA dla jądra komórkowego., Biorąc pod uwagę ten stan umysłu, łatwo zrozumieć, dlaczego obecność DNA w mitochondrialnych frakcjach była na ogół przypisywana skażeniu fragmentami jądrowymi. Histochemiczne plamy DNA, takie jak reakcja Feulgena, zabarwiały również kinetoplasty trypanosomów i „Nebenkern” plemników owadów, ale w tym czasie nie uznano jeszcze, że struktury te są w rzeczywistości nietypowymi mitochondriami., W cytoplazmie oocytów płazów Wykryto również ogromne ilości ekstranuklearnego DNA, ale wiele lat zajęło uświadomienie sobie, że DNA to w rzeczywistości mtDNA, którego obfitość odzwierciedlała ogromną ilość mitochondriów w tych dużych komórkach. W 1961 roku na piątym dorocznym spotkaniu American Society of Cell Biology w Chicago Hans Ris pokazał mikrografy elektronowe mitochondriów z inkluzjami przypominającymi nukleoidy bakterii zawierające DNA i przedstawił heretycką propozycję, że mitochondria (a także chloroplasty) zawierają własne DNA., W artykule, który ukazał się w następnym roku, RIS i Walter s Plaut dalej udokumentowali i rozszerzyli te obserwacje. Wkrótce potem dowody biochemiczne i morfologiczne z kilku grup potwierdziły obecność DNA w chloroplastach.
odkrycie chloroplastowego DNA sprawiło, że biochemicy przyjrzeli się wczesnym odkryciom Margaret Mitchell i Borisa Ephrussi, że pewne mutacje wpływające na funkcję mitochondriów w pleśni Neuropora crassa i drożdży Saccharomyces cerevisiae nie były dziedziczone zgodnie z prawami Mendla., Kuszące wydawało się spekulowanie, że nieznane „czynniki pozachromosomalne” uwikłane w te mutacje to w rzeczywistości mtDNA.
do 1962 r.grunt pod koncepcję mtDNA był więc dobrze przygotowany, ale sama koncepcja nie została ogólnie przyjęta. Z perspektywy czasu wydaje się, że środowisko naukowe czekało na przekonujące badania, które udokumentowały istnienie mtDNA za pomocą kilku różnych metod.
jedno z tych badań pochodziło od mikroskopistów elektronowych Margit MK Nass i Sylvana Nass, którzy wówczas pracowali w Wenner Gren Institute na Uniwersytecie w Sztokholmie., Wykazali, że matryca mitochondriów zarodka kurzego z osmu zawierała nitkowate inkluzje, których wygląd po różnych procedurach utrwalania był zbliżony do wyglądu nukleoidów bakterii bez histonu: po utrwaleniu tetroksydkiem osmu, inkluzje pojawiły się w grudkach o średnicy ~400 Å; utrwalenie tkanek tetroksydkiem osmu, a następnie leczenie octanem uranylu przed odwodnieniem sprawiło, że wyglądały jak cienkie włókna 15-30 Å., Jeszcze bardziej przekonującym dowodem na obecność DNA w tych inkluzjach była obserwacja, że inkluzje mogą być usunięte przez leczenie lekko ustalonej tkanki embrionalnej z Dnazą. Leczenie pepsyną, Rnazą lub buforem wolnym od DNazy było nieskuteczne. Klarowność tych mikrofrografów elektronowych i staranne kontrole, które zostały zawarte miały przekonujący wpływ na biologów komórkowych. MMK Nass i S Nass opublikowali swoje prace w dwóch zeszytach w 1963 roku w Journal of Cell Biology., W tym czasie jednak biologia komórki i biochemia były nadal raczej różnymi dyscyplinami i większość biochemików nie przeglądała czasopism poświęconych biologii komórki. Minęło więc trochę czasu, zanim odkrycia MMK Nass i S Nass weszły do świadomości społeczności biochemicznej.
w tym samym czasie Ellen Haslbrunner, Hans Tuppy i Schatz z Instytutu Biochemii Uniwersytetu Wiedeńskiego próbowali znaleźć biochemiczne podstawy dla mutacji pozakomórkowych, które zniosły czynność oddechową u drożdży S. cerevisiae., We wczesnych latach 60. wielu biochemików nadal niechętnie uważało „granulki oddechowe” drożdży za prawdziwe mitochondria, co umieściło badania Haslbrunnera i in. poza głównym nurtem biochemii mitochondrialnej w Stanach Zjednoczonych i gdzie indziej.
aby szukać DNA w mitochondriach, wybrano podejście biochemiczne. Mitochondria drożdży zostały oczyszczone najlepszymi dostępnymi metodami, a ich zawartość DNA została zmierzona za pomocą uświęconej od dawna reakcji barwnej „Diesche”., Kilka lat wcześniej de Duve i współpracownicy wykazali, że odwirowanie subkomórkowych frakcji do równowagi w gradiencie gęstości często dawało czyste oddzielenie różnych organelli. Co zaskakujące, zwykłe gradienty sacharozy nie oddzielały mitochondriów drożdży od fragmentów jądrowych, ale kiedy sacharoza została zastąpiona przez środek kontrastujący promieniami rentgenowskimi „Urografina”, mitochondria utworzyły niezwykle ostre pasmo, a DNA było obecne tylko w dwóch frakcjach: większość znajdowała się na dnie probówki wirówki, a bardzo mała ilość, ale dyskretny szczyt pokrywał się dokładnie z mitochondriami., DNA w dolnej frakcji było łatwo trawione przez Dnazę i najwyraźniej reprezentowało DNA jądrowe. DNA we frakcji mitochondrialnej nie było łatwo trawione przez Dnazę, chyba że organelle zostały najpierw zakłócone kwasem trichlorooctowym; przypuszczalnie reprezentował DNA zamknięte przez błony mitochondrialne. Jego stężenie było bardzo stałe między różnymi eksperymentami – od 1 do 4 µg mg−1 białka mitochondrialnego. Urografina-oczyszczone mitochondria z wątroby szczura, nerki szczura i serca bydła-zawierały prawie 10 razy mniej DNA, od 0,2 do 0,6 µg DNA na mg białka., Obliczono, że typowy mitochondrion ssaków zawiera 3 × 10-17 G DNA. Zakładając, że DNA jest dwuniciowe, może kodować nie więcej niż 1,2 MDa łańcuchów polipeptydowych. Wynik ten został uznany za ważny, ponieważ zdecydowanie wykluczył możliwość kodowania przez mtDNA wszystkich białek mitochondrialnych. Dzisiaj, to wczesne obliczenia Haslbrunner et al. można było zakwestionować z kilku powodów, ale było to niezwykle bliskie rzeczywistości: 13 polipeptydów kodowanych przez mtDNA ssaków ma całkowitą masę równą 0.,423 MDa, a pozostałą część potencjału kodującego stanowią w dużej mierze geny rybosomalne i transferowe RNA, a także fakt, że mitochondria mają zwykle więcej niż jedną kopię genomu DNA.
