wpływ rbST na wydajność mleka
Tabela 2 przedstawia podsumowanie wydajności mleka dla rbST i grup kontrolnych, wyrażone jako średnie i standardowe odchylenie produkcji mleka (Kg na dobę) w każdym cyklu leczenia, jak również różnicę produkcji między obiema grupami (% rbST na dzień).dodatkowe mleko produkowane przez grupę rBST w porównaniu ze zwierzętami kontrolnymi)., Od cyklu 0 do cyklu 3 wydaje się, że produkcja mleka wzrasta w obu grupach, co może wskazywać, że zwierzęta nie osiągnęły jeszcze szczytu laktacji. Chociaż pierwsza dawka rbST została podana około 2 miesięcy po porodzie, zgodnie z zaleceniami producenta, ważne jest, aby pamiętać, że zalecenie to opiera się na modelach matematycznych, które lokalizują szczyt produkcji mleka w 60-90 dniach po porodzie., Modele te są jednak tylko podejściami teoretycznymi, a dni w mleku (DIM) w szczytowym okresie mlecznym charakteryzują się dużą zmiennością między stadami i krowami, uwarunkowaną m.in. dobrostanem i karmieniem37. Od cyklu 4 do końca badania można było zaobserwować spadek produkcji mleka krów kontrolnych, podczas gdy zwierzęta leczone rbST utrzymywały swoją produkcję na stosunkowo stałym poziomie przy średniej 30-35 kg mleka dziennie, wykazując wyraźną tendencję spadkową dopiero po przerwaniu leczenia hormonalnego(cykle 14, 15 i 16)., W tym momencie różnice produkcyjne obserwowane między grupami powróciły do poziomów bardzo zbliżonych do tych obserwowanych w cyklu 0. Niezwykły jest fakt, że produkcja mleka była znacznie wyższa w grupie rbST niż w grupie kontrolnej podczas całego badania, z wyjątkiem cyklu 6, Kiedy zwierzęta te produkowały tylko o 5% więcej niż osoby z grupy kontrolnej (Tabela 2). Na podstawie zalecanego przez producenta schematu podawania rbST co dwa tygodnie, w 70. dniu Grupa leczonych zwierząt powinna była otrzymać nową dawkę rekombinowanego hormonu wzrostu., Dawka ta nie została jednak zastosowana, aby móc ocenić, czy grupa rbST może odzyskać profil transkrypcyjny przed podaniem dawki po 28 dniach bez podawania hormonów (ryc. 1). Prawdopodobnie z powodu tego braku hormonu zniknęły istotne statystycznie różnice istniejące w produkcji mleka między tymi dwiema grupami, podkreślając wpływ rbST na tempo produkcji mleka (Tabela 2). W 84. dniu ponownie podano rbST i ponownie pojawiły się znaczące różnice w produkcji mleka między dwiema grupami (24%)., W cyklu 12 zaobserwowano maksymalną różnicę o 43% więcej mleka u leczonych zwierząt w odniesieniu do krów kontrolnych, zarówno związaną z utrzymaną produkcją spowodowaną rbST, jak i naturalnym spadkiem u samic kontrolnych. Co ciekawe, te istotne różnice utrzymywały się do końca badania, nawet prawie dwa miesiące po podaniu ostatniej dawki (12.Dawka, dzień 168) (Tabela 2).
RNA isolation from BOV somatic cells
MSCs are easy-to-collect source of RNA for gene expression studies, as these cells can be isolated from raw milk following a very simple protocol. Poza tym pobieranie próbek jest tanie i nieinwazyjne, ponieważ mleko można zbierać w pomieszczeniu udojowym bez bezpośredniego kontaktu ze zwierzęciem, a zatem bez powodowania stresu, który mógłby zmienić uzyskane wyniki. W tym badaniu leczenie rbST nie miało istotnego wpływu (P = 0.,099) na ilość RNA wyizolowanego z MSCs, ze średnim stężeniem 120,69 ± 68,31 µg mL-1 w próbkach z grupy rbST i 132,36 ± 68,86 µg mL−1 w próbkach z grupy kontrolnej. Średnia wartość stosunku A260 / 280 wynosiła 1,766 ± 0,095. Możliwe jest, że etap oczyszczania z kolumnami spinowymi zwiększył stosunek A260/280, a tym samym czystość próbek RNA. Chociaż włączenie tego etapu zwiększa cenę próbki w rutynowej analizie, umożliwia uzyskanie próbek o wyższej czystości. Średnia wartość RIN obserwowana dla analizowanych próbek wynosiła 6,88 ± 0.,Niektóre czynniki mogą mieć wpływ na integralność próbek. Próbki wykorzystane w tym badaniu to komórki somatyczne bydła wyizolowane z mleka. Mleko charakteryzuje się złożoną mikrobiotą i Rnazami pochodzącymi z tej mikrobioty, które mogą być odpowiedzialne za niższą integralność RNA. Ponadto niektóre komórki somatyczne obecne w mleku mogą być częściowo zdegradowane. Fakty te zaobserwowano również w badaniu, w którym wykorzystano bydlęcy rozmaz pochwy do badań nad transkryptomiką w celu znalezienia biomarkerów do śledzenia niewłaściwego stosowania środków anabolicznych38., Również proces doju, zbierania mleka i transportu do laboratorium może, mimo że jest przeprowadzany tak szybko, jak to możliwe, wpłynąć na integralność RNA.
wpływ rbST na geny osi somatotropowej
do projektowania płytek OpenArray® wykorzystywanych w tym badaniu wybrano zestaw 18 genów (Tabela 1). Ta selekcja opierała się na potencjale tych genów do uzyskania charakterystycznej transkryptomicznej sygnatury rbST, która mogłaby być stosowana jako standard do kontroli ab (use) rbST u bydła mlecznego., Wcześniejsze badania ekspresji genów z rbST zostały zaprojektowane jako badania jednodawkowe i jednodawkowe w badaniu pośmiertnym tkanki sutkowej27 lub badania wielodawkowe (pięć dawek) z pobieraniem próbek krwi i mięśni w badaniu vivo31. Metody te są uważane za inwazyjne, stosunkowo drogie i dlatego niepraktyczne do celów kontroli w gospodarstwach mlecznych. W przypadku somatotropiny kontrola musi być przeprowadzona in vivo, ponieważ ostatecznym celem jest uniknięcie wejścia mleka rbST na rynek mleczny.,
w tym badaniu ekspresja IGF-1 została wykryta tylko we wszystkich punktach próbki u jednej krowy (krowa 7) leczonej rbST i nie była wykrywalna w MSCs grupy kontrolnej. Fakt, że możliwe było tylko wykrycie celu IGF-1 we wszystkich punktach próbki u jednej krowy, może wskazywać na istnienie różnych lokalnych odpowiedzi gruczołów sutkowych na egzogenne rbST wśród osób. Większość cząsteczek IGF-1 występujących w krążeniu wiąże się z wysokim powinowactwem do jednego lub więcej z sześciu znanych białek wiążących IGF-1 (IGFBP–1-6), które modulują biodostępność IGF-1 w tkankach docelowych39., W poprzednich badaniach zaobserwowano, że rbST silnie wpływa na wzrost stężenia IGFBP-5 w mięśniach szkieletowych cattle31 i obniża stężenie IGFBP-3 w tkance sutkowej32. Jednak w tym badaniu w żadnym momencie nie wykryto transkryptów IGFBP-3 ani IGFBP-5. Wynik ten może wynikać z tego, że MSCs składa się głównie z leukocytów40, w których represyjne działanie IGFBP może nie być tak ważne jak w tkance sutka. Dlatego w tym badaniu zarówno białka wiążące IGF-1, jak i IGF-1 są odrzucane jako potencjalne markery w komórkach somatycznych.,
innym kluczowym składnikiem osi somatotropowej jest receptor IGF-1 (IGF-1R), który jest głównym receptorem sygnałowym dla IGF-1, który pośredniczy w większości jego efektów biologicznych. W dniu 1 w grupie rbST (0,348 ± 0,131) stwierdzono znamiennie (p < 0,001) większą względną obfitość IGF-1R niż w grupie kontrolnej (0,0898 ± 0,0486). W różnych badaniach oceniających stężenie rbST we krwi po podaniu zaobserwowano, że wyższe stężenia tego rekombinowanego hormonu stwierdzono po podaniu rbst14, 15., Dlatego istotne różnice obserwowane w leczonej grupie mogą być spowodowane jako odpowiedź na IGF-1 zsyntetyzowany jako odpowiedź wyższe stężenia rbST u leczonych krów po podaniu pierwszej dawki. Na Rys. 2, można zaobserwować, że względna obfitość IGF – 1R dla dwóch pierwszych cykli podawania rbST była również znacznie wyższa w grupie rbST niż w grupie kontrolnej w wielu punktach próbki. Co ciekawe, w 84. dniu badania względna obfitość IGF-1R była podobna w grupie rbST (0,070 ± 0,057) i w grupie kontrolnej (0,110 ± 0,030)., Ten dzień zbiegł się z szóstym podaniem rbST, a pomiędzy tą dawką a piątą dawką występowała przerwa wynosząca 28 dni zamiast 14 dni. Dlatego możliwe jest, że grupa rbST odzyskała fizjologiczny poziom IGF-1R po kilku dniach bez rbST, wykazując nawet efekty wycofania regulacji w dół na transkrypcję IGF-1R. Wyniki te wskazują, że IGF-1R jest możliwym dobrym kandydatem do włączenia do panelu genów w celu wykrycia stosowania rbST w gospodarstwach mlecznych., Chociaż inni autorzy nie znaleźli istotnego wpływu rbST na poziomy IGF-1R w mięśniach szkieletowych31, w tym badaniu zaobserwowano wyraźną odpowiedź na poziomy transkryptu tego receptora w MSCs. W tym sensie leukocyty, neutrofile i monocyty mogą wytwarzać hormon wzrostu i IGF-1 oraz wyrażać swoje receptory, które wskazują,że szlaki sygnałowe IGF-1/IGF-1R mogą wywierać funkcje regulacyjne na układ odpornościowy, w tym proliferację komórek odpornościowych41, 42. Różnica między tymi dwoma badaniami może wynikać z różnych zastosowanych matryc., MSCs może prawdopodobnie lepiej reagować na wyższe poziomy krążącego IGF-1 i zwiększyć liczbę receptorów dla tej cząsteczki w ich błonie
względna obfitość IGF-1R i ccnd-1 w pierwszym i drugim cyklu podawania rBST w grupie kontrolnej (N=3) i grupie leczonej (N = 6). Nieparametryczny Test U Manna-Whitneya został użyty do porównania wydajności mleka w każdym cyklu pomiędzy grupą leczoną i grupą kontrolną., Gwiazdki reprezentują statystycznie istotne różnice pomiędzy grupą leczoną a grupą kontrolną. *(p < 0.05), **(p < 0.01), ** * (p < 0.001).
wpływ rbST na geny związane z układem odpornościowym
czynnik martwicy nowotworu (TNF) i interleukina-1β (IL-1β) to dwie cytokiny blisko związane z układem odpornościowym43., Prawdopodobnie ze względu na ich związek możliwe było zidentyfikowanie podobnych tendencji we względnej obfitości transkryptów TNF i IL-1β w całym badaniu. Podawanie rbST spowodowało znaczny wzrost względnej obfitości transkryptów TNF i IL-1β. Warto wspomnieć, że w dniach 9, 23 i 35 względna obfitość TNF i IL-1β była znacząco wyższa w grupie rbST w porównaniu do grupy kontrolnej (rys. 3). Te dni odpowiadają drugiego tygodnia cykli rbST, około 7-9 dni po wstrzyknięciach Lactotropina®., Dlatego możliwe jest, że zmiany transkryptomiczne spowodowane przez rbST w tych dwóch cytokinach są bardziej widoczne w drugim tygodniu cyklu rbST. Co ciekawe, w dniu 84 (28 dni po podaniu 5. rbST) nie było znaczących różnic między grupami (rys. 3). W tym kontekście inne wcześniejsze badania wykorzystywały potężne technologie transkryptomiczne do wykrywania użycia środków anabolicznych w cattle26, 38., W badaniach tych zaobserwowano również zwiększoną transkrypcję IL-1β, jedną z nich znaczno26, co jest bardzo interesujące, ponieważ w badaniu, o którym mowa, wykorzystano komórki krwi, których skład jest bardzo podobny do MSCs, ponieważ mają one wysoki odsetek białych krwinek. Jednak wcześniej wspomniane badania nie wykazały wpływu środków anabolicznych na TNF, podczas gdy obecne badania wykazały silny wpływ podawania rbST na względną obfitość TNF., W związku z tym doniesiono, że egzogenne podawanie rbST w okresie laktacji może wzmocnić odpowiedź immunologiczną u krowi44. W rzeczywistości liczba komórek somatycznych mleka zwiększała się wcześniej i szybciej u krów cierpiących na zapalenie sutka coliforme, gdy podawano rbst45. Hormon wzrostu i jego rekombinowana wersja wykazują zdolność do modulacji reakcji zapalnej i obrony neutrofilów gruczołu mlekowego bydła mlecznego w zdrowiu i chorych krowach45. Może to wyjaśniać wzrost liczby TNF i IL-1β u krów leczonych rbST.,
w badaniach przesiewowych przy użyciu transkryptomiki bardzo trudno jest znaleźć konkretny gen, który mógłby być użyty jako bardzo wiarygodny Gen. Należy zauważyć, że zarówno IL – 1β,jak i TNF mogą być regulowane w innych procesach jako subkliniczne zapalenie sutka46, 47. Różne badania przeprowadzone w Stanach Zjednoczonych wykazały, że duże gospodarstwa są bardziej skłonne do przyjmowania rbST,co sugeruje nie tylko potencjalny Składnik wykorzystania rbST i jego opłacalność w odniesieniu do wielkości gospodarstwa, ale także składnik podmiotów gospodarczych (wiek i wykształcenie) 48, 49., Rekombinowana somatotropina była często opisywana jako technologia intensywna w zarządzaniu, związana z wykorzystaniem innych technologii zorientowanych na wydajność i praktyk zarządzania, które są charakterystyczne dla większych gospodarstw,rzadziej wśród pasterzy 49,50. W tym sensie subkliniczne zapalenie sutka powoduje zmniejszenie produkcji mleka u dotkniętych krowami51. Dlatego interesujące powinno być połączenie danych z testów transkryptomicznych z danymi dotyczącymi produkcji mleka., Może również towarzyszyć test mikrobiologiczny mleka podejrzanych krów w celu wykrycia głównych patogenów związanych z subklinicznym zapaleniem sutka. Ale to, co naprawdę zwiększa potencjał dyskryminacji, to włączenie większej liczby genów do panelu.
wpływ rbST na cykl komórkowy, proliferację, różnicowanie i adhezję
wiadomo, że rbST zwiększa syntezę mleka poprzez zwiększenie obrotu (proliferacja/apoptoza) i aktywności komórek nabłonka sutka, co wskazuje, że rbST wpływa na szlaki metaboliczne, które regulują obrót / cykl komórkowy i metabolizm52., Cykl komórkowy jest kontrolowany przez cykliny i kinazy zależne od cyklin. Z nich cyklina D (kodowana przez gen CCND1) koordynuje progresję cyklu komórkowego poprzez stymulację zewnątrzkomórkową (np. czynnik wzrostu, dostępność składników odżywczych) i napędza progresję fazy G1 do fazy S, powodując mitozę komórkową. Jednak większość dorosłych komórek utrzymuje się w stanie spoczynku, znanym jako faza G0, czyli stan spoczynku, i mogą ponownie wejść do cyklu komórkowego w fazie G1 pod wpływem odpowiednich bodźców mitogennych53. W tym badaniu zaobserwowano, że leczenie rbST silnie wpływa na transkrypcję CCND1., Przed pierwszą dawką rbST nie stwierdzono istotnych różnic między grupą kontrolną a grupą rbST (rys. 3). Jednak po podaniu pierwszej dawki można było zaobserwować znaczne różnice między dwiema grupami w różnych punktach próbkowania. Względna obfitość CCND1 była znacząco wyższa w grupie rbST niż w grupie kontrolnej w dwóch pierwszych cyklach leczenia rbST (ryc. 2). Efekt ten wydaje się być szczególnie widoczny 9 dni po podaniu rbST, podobnie jak transkrypty TNF i IL-1β., Tak więc, w dniach 9, 23 i 35 badania, względna liczebność CCND1 była znacznie wyższa w grupie rbST niż w grupie kontrolnej (rys. 3). Wreszcie, w dniu 84 (28 dni po podaniu 5. rbST), nie było znaczących różnic między grupami (rys. 3) podobnie jak w przypadku cytokin. Ponadto, w ostatnim dniu (219) pobierania próbek (51 dni po podaniu ostatnich dawek rbST) nie stwierdzono istotnych różnic (P > 0,05) między grupą rbST (0,433 ± 0,141) a grupą kontrolną (0,430 ± 0,178)., Dlatego egzogenne podawanie rbST powoduje nadmierną ekspresję CCND1. Może to prowadzić do aktywacji komórki w fazie G0, a w szczególnym przypadku tkanki sutkowej do wzrostu produkcji mleka poprzez zwiększenie liczby komórek pęcherzykowych gruczołu sutkowego54.
inne geny związane z cyklem komórkowym to białko nowotworowe D52-like 2 (TPD52L2) i sirtuin 2 (SIRT2). W sposób podobny do obserwowanego dla CCND1, TNF i IL-1β, można było znaleźć znacznie większą (p < 0,001) względną obfitość transkryptów SIRT2 w grupie rbST (1.,517 ± 0,199) niż w grupie kontrolnej (0,506 ± 0,250) w 23.dniu badania, ale w tym przypadku tylko podczas drugiego cyklu podawania rbST (rys. 4). Podwyższony poziom transkryptów CCND1 i SIRT2 po drugim podaniu Lactotropina® w leczonej grupie może być wynikiem wpływu egzogennego rbST na cykl komórkowy. Krążenie tego hormonu peptydowego w organizmie spowodowałoby aktywację cyklu komórkowego w komórkach docelowych., Jednak w innych cyklach rbST zależność między podaniem dawki a zmianami względnej ilości transkryptów SIRT2 nie była tak widoczna jak w drugiej dawce. Oprócz powyższego, niezwykłe jest to, że w grupie leczonej występowała znacznie większa względna liczba transkryptów TPD52L2 (p < 0, 05) w ciągu 4 dni po pierwszym podaniu rbST. Innym składnikiem biorącym udział w metabolizmie komórkowym ze względu na jego istotną rolę w translacji jest eukariotyczny współczynnik elongacji 1 gamma (EEF1G).,
Ewolucja względnej obfitości niektórych genów docelowych we wszystkich punktach badania w grupie leczonej rbST (N = 6) i grupie kontrolnej (N = 3).
w tym badaniu względna liczba transkryptów EEF1G nie wykazywała wyraźnej tendencji związanej z podawaniem rbST., Jednak w dniach 17 i 30 (odpowiednio 3 i 2 dni po podaniu drugiej i trzeciej dawki rbST) względna liczba transkryptów EEF1G była znacznie większa w grupie rbST. W poprzednim badaniu27 stwierdzono, że leczenie rbST zwiększa poziom transkryptów EEF1G w tkance sutkowej, ale wykorzystano tylko jeden punkt próbki 6 dni po podaniu somatotropiny. Dlatego nie jest możliwe bezpośrednie porównanie tych wyników z wynikami uzyskanymi w tym badaniu, w którym do testów transkryptomicznych w ciągu 8 miesięcy wykorzystano 36 punktów próbki., Innym genem włączonym do tego badania jest globulka tłuszczu mleka-białko czynnika EGF 8 (mfge8). Na Rys. 4, można zaobserwować, że względna obfitość MFGE8 w grupie rbST miała dużą zmienność między dobami pobierania próbek. W szczególności McCoard et al.Zaobserwowano, że 6 dni po podaniu rbST względna obfitość MFGE8 w tkance sutka bydlęcego była większa. Jednak, jak wspomniano wcześniej, badanie to obejmowało tylko jeden punkt danych po podaniu pojedynczej dawki rbST., Obecny długoterminowy wielodawkowy eksperyment wykazał, że wzorce transkrypcji u bydła leczonych rbST wykazują dużą zmienność w czasie. Na przykład dane uzyskane dla CCND1 wykazały, że wpływ rbST na transkrypcję niektórych genów wzrasta wraz z liczbą dawek. Chociaż możliwe jest, że rbST wpływa na transkrypcję genu MFGE8, uzyskane wyniki wykazały zarówno regulację w górę, jak iw dół., W związku z tym MFGE8 nie może być zaproponowany jako idealny kandydat do śledzenia stosowania rbST (ab)u bydła, ponieważ nie było możliwe zaobserwowanie wyraźnej tendencji w jego transkrypcji. Innym genem związanym z przyleganiem komórek ocenianym w tym badaniu jest catenin Alfa-like 1 (CTNNAL1). Nie udało się jednak znaleźć znaczących różnic w jego transkrypcji w wyniku podania rbST.
inne geny
laktoferyna (LTF) jest glikoproteiną wiążącą żelazo, należącą do rodziny transferryn55., Rysunek 4 pokazuje ewolucję względnej obfitości genu LTF we wszystkich punktach próbki ocenianych w tym badaniu. Chociaż w poprzednich badaniach z substancjami anabolicznymi w cattle38 obserwowano wzrost regulacji LTF, nie było możliwe ustalenie wyraźnej tendencji LTF w odniesieniu do leczenia rbST. Na przykład w dniach 9 i 53 względna liczebność LTF jest znacznie niższa u zwierząt leczonych rbST. Jednak w 91. dniu względna liczebność była znacznie wyższa w tej grupie. Konieczne jest omówienie wyników uzyskanych dla genu kolagenu typu III α1 (COL3A1)., W poprzednim badaniu stwierdzono, że leczenie rbST u bydła mlecznego powoduje wzrost regulacji genu COL3A1 w tkance sutka 6 dni po podaniu rbst27. Jednak w niniejszej pracy nie było możliwe wykrycie transkryptów genu COL3A1. Również transkrypcja ESR2 nie została wykryta w tym badaniu.
panel genów do monitorowania stosowania rbST (ab)u bydła mlecznego
ostatecznym celem tej pracy było zaproponowanie rutynowego panelu genów, których połączony wzór transkrypcji pozwoliłby na opracowanie metody przesiewowej w celu kontroli niewłaściwego stosowania rbST w gospodarstwach mlecznych za pomocą MSCs., W przeciwieństwie do innych poprzednich badań27, 31,32, w pracy przeanalizowano wzorce transkrypcji genów związanych z rbST w 8-miesięcznym eksperymencie w warunkach rzeczywistych, obejmującym 12 cykli podawania rBST i zwierząt kontrolnych. Takie podejście umożliwiło uzyskanie dokładniejszych danych w celu odróżnienia krów leczonych rbST od krów kontrolnych.
przeprowadzono wielowymiarową analizę statystyczną w celu wyjaśnienia zmian we wzorcach transkrypcji MSCs jako konsekwencji podawania rbST., W tym celu wykorzystano jedynie transkrypcję dziewięciu genów, które zostały pomyślnie zmierzone w całym eksperymencie (IGF1R, CCND1, TNF, IL1ß, SIRT2, EEFG1, MFEG8, LTF, TDP52L2), z wyłączeniem tych genów, które wyrażały się tylko w bardzo niewielu przypadkach/próbkach. Głównym celem analizy PCA jest identyfikacja globalnych wzorców w danych, wykrywanie korelacji między różnymi zmiennymi, tj. w tym konkretnym przypadku transkrypcji różnych genów., Projekcja próbek do nowej wielowymiarowej przestrzeni głównych składników (PCs) potencjalnie pozwoli różnicowanie między rbST i grupy kontrolnej, podkreślając również te geny z większą zdolnością jako biomarkery leczenia. Na wykresie punktowym analizy PCA pokazanym na Rys. 5, można zauważyć tendencję do grupowania w dwóch grupach próbek MSC, ze zwierzętami leczonymi rbST zidentyfikowanymi jako czerwone kółka, a zwierzętami kontrolnymi jako czarne skrzynki i oznakowanymi zgodnie z dniem eksperymentu., Różne próbki grupy rbST pojawiły się zmieszane z kontrolkami po lewej stronie działki, ale, co ciekawe, większość z nich odpowiada dobie podawania somatotropiny (dni 14, 28, 57 lub 84) lub pierwszym 2-3 dniom po dawce (dni 2, 3, 17, 44 lub 115), w których nie wykryto wyraźnego zaburzenia transkryptomicznego. Wręcz przeciwnie, bardzo niewiele zwierząt kontrolnych można by zaklasyfikować jako leczone krowy na PCA, a ich sytuację wyjaśniają skrajne wartości, w szczególności słabo dyskryminujące geny, takie jak LTF, MFGE8 lub SIRT2.,
Wykres PCA zbudowany przy użyciu pełnych profili transkryptomicznych komórek somatycznych mleka (MSCS), w którym dyskryminacja krów leczonych rbST (N = 6, czerwony kręgów) i zwierząt kontrolnych (N = 3; czarne skrzynki). Próbki MSC są etykietowane zgodnie z dniem doświadczenia, a dzień 0 jest dniem pierwszej dawki rbST u leczonych zwierząt.,
profile transkryptomiczne poddano również opls-DA, z którego wskazywano również potencjalne geny dyskryminujące. Na Rys. 6a, przedstawiono wizualną reprezentację modelu wielowymiarowego, z próbkami MSC ze zwierząt kontrolnych wykreślonymi jako czarne kwadraty i próbkami z grupy rbST jako czerwone okręgi. W podobny sposób jak w przypadku PCA, kilka próbek rbST jest rzutowanych między próbkami kontrolnymi po lewej stronie elipsy., Jednak próbki te zostały pobrane, gdy zaburzenia transkryptomiczne spowodowane przez rbST zniknęły (lub nie pojawiły się jeszcze), tak ściśle, że mogły być klasyfikowane jako kontrole w tym konkretnym momencie. Z drugiej strony, bardzo niewiele próbek kontrolnych zostało błędnie zaklasyfikowanych jako rbST. Jeśli tak jak w tym przypadku nie jest dostępny zestaw testów, główną strategią oceny jakości modelu jest metoda walidacji krzyżowej. Wyniki procedury walidacji krzyżowej są podsumowane przez wartość różnych parametrów jakościowych., W tym badaniu model wielowymiarowy OPLS wykazał następujące cechy: R2(X) = 0,6, R2(Y) = 0,4 i Q2 = 0,3. Model wyjaśnia 60% zmienności w przestrzeni x i 40% zmienności w przestrzeni y, a dobroć przewidywania wynosi 30%. Wartości te wskazują na stosunkowo dobry opis danych według modelu i średnią przewidywalność34. Wartość p obliczona na podstawie CV-ANOVA wynosiła 3,01 × 10-7, co sugeruje istnienie znaczących różnic między dwiema klasami modelu., Fakt, że model ten został zbudowany z panelu genów o różnych zdolnościach rozróżniających, nie powinien być ignorowany, ponieważ wpływa na moc rozróżniającą OPLS. Poza tym, te eksperymentalne dni z bardzo małym lub zerowym wpływem rbST na ich transkrypcje zdecydowanie wpływają na model, ponieważ w praktyce należą do jednej grupy, ale działają jak druga., W przyszłych wielowymiarowych modelach przesiewowych należy użyć panelu wybranych wysoce dyskryminujących genów, a najlepiej „znanych ” i” nieznanych ” próbek, które mają być wyświetlane w modelu wielowymiarowym, będą należeć do podobnych populacji (wiek, rasa, itp.) i momentów laktacyjnych, w celu przezwyciężenia zmienności międzyosobniczej zwierzęcej35. W tego rodzaju podejściach ważne jest również, że populacja predykcyjna jest większa niż przewidywane próbki. Wreszcie, przyczyny dyskryminacji na OPLS-DA zostały zbadane w odpowiedniej s-działki (rys., 6b), który ujawnił udział każdej zmiennej (transkrypcji genów) w rozdzieleniu dwóch klas próbek. Jak komentowano w poprzednich sekcjach, najbardziej dyskryminującą transkrypcję w MSC stwierdzono w genach CCND1, IGF-1R, TNF i IL-1β. Wydaje się oczywiste, że zabiegi rbST wywołują wzrost regulacji tych genów, a ich zastosowaniew przyszłych panelach monitorujących jest obiecującą opcją rutynowej kontroli w mleczarniach.,
Wykres rozrzutu OPLS-DA (A) zbudowany przy użyciu profili trasncriptomicznych z komórek somatycznych mleka, pokazujący dyskryminację między kontrolami (N = 3; czarne okręgi) i rBST (N = 6; czerwone kropki) zwierzęta, oznakowane zgodnie z doświadczalnym dniem (dzień 0 to dzień pierwszej dawki w grupie rBST). S-Wykres (b) związany z analizą dyskryminacyjną opls, podkreślając geny bardziej dotknięte rbST w prawym górnym rogu wykresu, a tym samym z większą mocą dyskryminacyjną.,
Jednak z praktycznego punktu widzenia sugestia ta brzmi trochę nierealistycznie. Proponowana jest przypadkowa zbiórka mleka raz w tygodniu, naprzemiennie w dni tygodnia., Ponieważ somatotropina jest podawana regularnie w okresie laktacji (począwszy od 80-100 dni po porodzie, dwa razy w tygodniu), u wszystkich krów karmiących w gospodarstwie, z dobrym planem pobierania próbek, w pewnym momencie rbST należy wykryć w gospodarstwie. Dane transkryptomiczne uzyskane z pobranych próbek należy porównać z zestawem danych transkryptomicznych z populacji kontrolnej. Te próbki, które prezentowały wyższe wartości genów zaproponowanych w niniejszym artykule, należy uznać za podejrzane. Drugim krokiem powinno być zbadanie konkretnej sytuacji każdej „pozytywnej” krowy (zapalenie sutka, ciąża itp.,), a w razie potrzeby kontynuować analizę potwierdzającą. Ważne jest, aby podkreślić również wysoką przepustowość tego podejścia PCR w czasie rzeczywistym, co wykonalne plan pobierania próbek.
