Se vie tosissaan pitämään perustiedot molekyyli-ja solubiologian tuore, lisäksi kaiken muun, sinun täytyy tehdä. Eikö olisi hienoa, jos löytyisi paikka, josta löytyisi helposti luettavia artikkeleita, joiden avulla voisi harjata perusasiat parissa minuutissa?
– toivon, että sanoit ”kyllä”, koska tämä on tavoite minun ”Perusasiat:” artikkelisarja, jossa meillä on jo, ja on edelleen, tuo sinulle säännöllisesti. Tässä artikkelissa kerrotaan DNA-sidonnan perusteet.,
DNA: n Ligaatio Kaveri: DNA Ligase
DNA ligaasia (EY 6.5.1.1) on entsyymi ytimessä DNA: n ligaatio-reaktion. Se kovalenttisesti liittynyt fosfaatti selkäranka DNA tylsä tai yhteensopiva yhtenäinen päättyy (katso Kuva 1) ja se on luonnollinen rooli on korjaus kahden säikeen katkoksia DNA-molekyylejä. Molekyylibiologian se on yleisesti käytetty lisätään restriction entsyymi-syntyy DNA-fragmentit osaksi vektori runkoverkot. Kaupallinen ligases ovat mukana reaction buffer, jotka sisältävät ATP: n ja Mg2+, jotka molemmat ovat välttämättömiä ligase toimintaa., Koska ATP: tä voi vaurioittaa toistuvat jäätymissulatusjaksot, on suositeltavaa tehdä puskurista alikvotteja (katso artikkelini ”5 DNA ligation tips”).
Kuva 1. Yhtenäiset ja tylpät päät, valmiina DNA-sidontaan!
DNA-ligaatioreaktion kahdessa vaiheessa
itse DNA-ligaatioreaktiossa on kaksi perusvaihetta. Ensinnäkin DNA: n päät on törmättävä sattumalta ja pysyttävä yhdessä niin kauan, että ligaasi liittyy niihin. Tämä on tehottomin osa reaktiota, mutta on helpompaa alhaisissa lämpötiloissa. Miksi?, No, kuten te varmasti tiedätte, kaikki molekyylit liikkuvat nopeammin korkeammissa lämpötiloissa, joten voit kuvitella, että se on helpompaa kahden DNA-päät törmäävät toisiinsa ja pysyä yhdessä, jos ne kevyesti kelluvat ratkaisu alhaisessa lämpötilassa, pikemminkin kuin whizzing noin, kuten he olisivat korkeammissa lämpötiloissa. Yhtenäistä päättyy, on lisäksi syytä; alemmissa lämpötiloissa vakauttaa vety liimaus välillä täydentäviä nukleotidien, joka todella auttaa pitämään tavarat paikoillaan.
Kuva 2., DNA-ligaation entsymaattinen reaktio
toinen vaihe on entsymaattinen reaktio, joka esitetään kaaviossa 2.. DNA-ligaasi katalysoi 3′-OH: n liittymistä 5′-fosfaattiin kaksivaiheisen mekanismin kautta. Ensin AMP-nukleotidi, joka kiinnittyy entsyymin aktiivisessa kohdassa olevaan lysiinijäämään, siirtyy 5 ’ – fosfaattiin. Sitten AMP-fosfaattisidoksen kimppuun hyökkää 3 ’ – OH, muodostaen kovalenttisen sidoksen ja vapauttavan AMP: n. Jotta entsyymi suorittaa edelleen reaktiot AMP entsyymi on aktiivinen sivusto on täydennettävä ATP.,
Tässä on syy me suorittaa DNA: n Ligaatio alhaisissa lämpötiloissa voi auttaa
DNA ligase entsyymi on optimaalinen toiminta 25°C, jotta ligaatio reaktio suoritetaan lämpötilassa, joka on kauppa-off välillä, optimaalinen lämpötilat tuo DNA: n päät yhteen (1°C) ja entsymaattinen reaktio (25°C). Yleensä 1h klo 16°C on hieno, mutta koska tuo DNA: n päät yhteen on ainakin tehokas osa reaktio suosimalla tätä alentamalla lämpötila-4°C voi antaa jopa enemmän tehokkuutta. Entsyymi toimii kuitenkin hyvin hitaasti tässä lämpötilassa niin kauan (esim., yön yli) itämisaika on tarpeen.
julkaistu alun perin 31.lokakuuta 2007; päivitetty ja julkaistu uudelleen 5. joulukuuta 2014.
onko tämä auttanut sinua? Jaa sitten verkkosi kanssa.
