KESKUSTELUA
Gram-värjäys on eniten käytetty värjäys menettely bakteriologian. Sitä kutsutaan differentiaalitahraksi, koska se erottaa grampositiiviset ja gramnegatiiviset bakteerit toisistaan. Gram-värjäysmenetelmällä violettia tahraavia bakteereja kutsutaan Grampositiivisiksi; vaaleanpunaista värjääviä sanotaan Gramnegatiivisiksi. Termit positiivinen ja negatiivinen ei ole mitään tekemistä sen kanssa, sähkövaraus, mutta yksinkertaisesti nimetä kaksi eri morfologiset ryhmät bakteerit.,
grampositiiviset ja gramnegatiiviset bakteerit värjäytyvät eri tavalla, koska niiden soluseinien rakenteessa on perustavanlaatuisia eroja. Bakteerin soluseinän palvelee organismin sen koko ja muoto sekä estää osmoottisen lyysin. Jäykkyyttä aiheuttava bakteerisoluseinän materiaali on peptidoglykaani.
Vuonna electron micrographs, Gram-positiivisten solujen seinä näkyy niin laaja, tiheä seinä 20-80 nm paksu ja koostuu lukuisista toisiinsa kerrokset peptidoglykaanin (Kuvat 1A ja 1B). Kemiallisesti 60-90% Grampositiivisesta soluseinästä on peptidoglykaania., Grampositiivisten soluseinässä toisiinsa kietoutuvat teikhoehapot. Muun soluseinän läpi ja sen ulkopuolelle ulottuvat teichoehapot koostuvat glyserolin, fosfaattien ja sokerialkoholiribitolin polymeereistä. Joillakin on lipidi kiinnittyneenä (lipoteikhappo). Peptidoglykaanin ulkopinnalla on proteiineja, jotka eroavat bakteerin kannasta ja lajista.,
Gram-negatiivisiin soluseinän, toisaalta, sisältää vain 2-3 kerrosta peptidoglykaanin ja ympäröi ulompi kalvo, joka koostuu fosfolipideistä, lipopolysakkaridi, lipoprotein, ja proteiineja (Kuvat 2A ja 2B). Vain 10-20% Gramnegatiivisesta soluseinästä on peptidoglykaania. Fosfolipidit sijaitsevat pääasiassa ulomman kalvon sisäkerroksessa, samoin lipoproteiinit, jotka yhdistävät ulomman kalvon peptidoglykaaniin., Se lipopolysaccharides, joka sijaitsee ulompi kerros ulompi kalvo, joka koostuu rasva-osa nimeltään rasva On upotettu kalvo ja polysakkaridi osa ulottuu ulospäin bakteeri-pinta. Ulompi kalvo sisältää myös useita proteiineja, jotka eroavat bakteerin kannan ja lajin kanssa.,
lisätietoja Gram-negatiivisten ja Gram-positiivisten solujen seinä, ks. seuraavat Oppimisen Esineitä Luento-Opas:
- Prokaryoottinen Solu-Seinä; – Yksikkö 1, Kohta IIB2
- Gram-Positiivisten Solujen Seinä, Yksikkö 1, Kohta IIB2a
- Gram-Negatiivisiin soluseinän; Yksikkö 1, Kohta IIB2b
Gram-värjäys menettely liittyy neljä perusvaihetta:
1. Bakteerit värjätään ensin perusvärillä kidevioletti. Sekä grampositiiviset että Gramnegatiiviset bakteerit värjäytyvät suoraan ja näyttävät violeteilta tämän vaiheen jälkeen.,
2. Tämän jälkeen bakteerit hoidetaan gramman jodiliuoksella. Tämä mahdollistaa tahran säilymisen paremmin muodostamalla liukenemattoman kidevioletti-jodikompleksin. Sekä grampositiiviset että Gramnegatiiviset bakteerit pysyvät tämän vaiheen jälkeen violetteina.
3. Tämän jälkeen lisätään Gram ’ s decolorizer, etyylialkoholin ja asetonin seos. Tämä on eroaskel. Grampositiiviset bakteerit säilyttävät kidevioletti-jodikompleksin, kun taas Gramnegatiivit ovat dekolorisoituneita.
4. Lopuksi käytetään vastapainona safraniinia (myös perusväriä)., Koska grampositiiviset bakteerit ovat jo värjäytyneet violeteiksi, vastatahra ei vaikuta niihin. Gramnegatiiviset bakteerit, jotka ovat nyt värittömiä, värjäytyvät suoraan th e safraniinin vaikutuksesta. Näin grampositiiviset näkyvät violetteina ja Gramnegatiivit vaaleanpunaisina.
© Daniel Cavanaugh, Mark Innokas, kirjoittajat, Lisensoitu käytettäväksi, ASM MicrobeLibrary.,
nykyinen teoria takana Gram-värjäys, se on ajatellut, että Gram-positiivisia bakteereita, crystal violetti ja jodi muodostavat suurempi molekyyli, joka saostuu ulos solun sisällä. Alkoholi/asetoni-seokseen sitten aiheuttaa kuivumista monikerroksinen peptidoglykaanin, mikä vähentää tilan molekyylien välillä ja aiheuttaa soluseinän ansa crystal violet-jodi monimutkainen solun sisällä., Jos Gram-negatiiviset bakteerit, alkoholi/asetoni-seokseen, on rasva liuottimella, liukenee ulkomembraanin solun seinälle ja voi myös vahingoittaa solukalvoon, johon peptidoglykaanin on kiinnitetty. Peptidoglykaanin muutamat kerrokset eivät pysty säilyttämään kidevioletti-jodikompleksia ja solu on dekolorisoitunut.
on tärkeää huomata, että Gram-positiivisuus (kyky säilyttää purple crystal violet-jodi monimutkainen) ei ole kaikki-tai-ei-mitään-ilmiö vaan kysymys sen asteesta., On olemassa useita tekijöitä, jotka voivat aiheuttaa Gram-positiivisia organismin värjäys Gram-negatiivisesti:
1. Käytetty menetelmä ja tekniikat. Ylikuumenemisen aikana lämpöä korjaus, yli värinpoisto alkoholin kanssa ja jopa liian paljon pesu vedellä vaiheiden välillä voi aiheuttaa Gram-positiivisia bakteereita menettää crystal violet-jodi monimutkainen.
2. Kulttuurin aikakausi. Yli 24 tuntia Vanhat viljelmät saattavat menettää kykynsä säilyttää kidevioletti-jodikompleksi.
3. Itse organismi., Jotkut grampositiiviset bakteerit pystyvät säilyttämään kidevioletti-jodikompleksin paremmin kuin toiset.
siksi Gramvärjäyksessä on käytettävä hyvin tarkkoja tekniikoita ja tulkittava tuloksia harkiten.
Trypticase Soy agar levy kulttuurien Escherichia coli (pieni, Gram-negatiivinen sauva) ja Staphylococcus epidermidis (Gram-positiivinen coccus kanssa staphylococcus järjestely).
MENETTELY (tehtävä erikseen)
1., Escherichia coli,
a. Lämpö-fix preparaatti Escherichia coli seuraavasti:
1. Käyttämällä tiputin pullon ionivaihdettua vettä, joka löytyy värjäys teline, aseta 1/2 normaali kokoinen pisara vettä puhdas slide koskettamalla dropper dia (Kuva 1). Altenately, käytä steriloitu puhkeavan silmukka aseta tippa deionisoitua vettä diassa.
2., Käyttämällä steriiliä puhkeavan silmukka, aseptisesti poistaa pieni määrä kulttuuri-agar alustalle ja varovasti kosketa sitä 2 – 3 kertaa vettä ennen kuin vesi on selvästi sameaa (Kuva 2). Gramvärjäyksessä on olennaista hyvä mustamaalaus, jossa on oikea määrä bakteereja.
- Liian monet bakteerit diassa voi johtaa alle-värinpoisto; liian vähän voi johtaa yli-värinpoisto.
3. Polta loput bakteerit rokotussilmukkaan., Jos veteen lisätään liikaa kulttuuria, et näe värjättyjä yksittäisiä bakteereja, eikä sinulla välttämättä ole luotettavaa Gram-tahraa.
4. Kun rokotussilmukka jäähtyy, levitä suspensio noin puolelle liukumäestä muodostaen ohuen kalvon. Oikein valmistetun mustamaalauksen, jossa on oikea määrä bakteereja, pitäisi näyttää samalta kuin viikuna. 3.
5. Anna tämän ohuen suspension kuivua täysin (Kuva 4). Sivele on oltava täysin kuiva, ennen kuin liukumäki on lämpö kiinnitetty!
6., Lämpö-fix bakteerit dia,poimia ilmakuivattua dia peitinlasin pihdit ja pidä pohjassa liu ’ uta vastapäätä kokeena avaaminen lähellä microincinerator 10 sekunnin ajan (Kuva 5), kuten on osoitettu oma ohjaaja. Jos liukua ei kuumenneta tarpeeksi, kaikki bakteerit huuhtoutuvat pois. Jos se ylikuumenee, bakteerien rakenteellinen eheys voi vaurioitua.
b. tahra Huckerin kristallivioletilla minuutin ajan (Kuva 6). Pese varovasti vedellä (Kuva 7). Ravista ylimääräinen vesi pois, mutta älä läikytä kuiviksi vaiheiden välillä.
c., Tahraa gramman jodiliuoksella minuutin ajan (Kuva 8) ja pese varovasti vedellä.
d. Decolorize poimimalla liu ’ uta ja kerroit Gramma on decolorizer ajaa alas dia, kunnes violetti vain lakkaa virtaamasta alareunassa dia (Kuva 9).
- varmista, että koko kokeena on tasaisesti värittömäksi ja, että et ole alle-decolorizing tai yli-decolorizing.
- Pese välittömästi vedellä.
e. tahra safraniinilla minuutin ajan (Kuva 10)., Kun peset ylimääräisen safraniinin pois, pese varovasti ja lyhyesti, sillä osa bakteerissa olevasta sarfaniinista on mahdollista pestä pois.
f. Blot kuiva (Kuva 11) ja tarkkaile öljykylpymikroskopialla.
2. Staphylococcus epidermidis
a. Lämpö-fix preparaatti Staphylococcus epidermidis seuraavasti:
1. Käyttämällä tiputin pullon ionivaihdettua vettä, joka löytyy värjäys teline, aseta 1/2 normaali kokoinen pisara vettä puhdas slide koskettamalla dropper dia (Kuva 1)., Altenately, käytä steriloitu puhkeavan silmukka aseta tippa deionisoitua vettä diassa.
2. Käyttämällä steriiliä puhkeavan silmukka, aseptisesti poistaa pieni määrä kulttuuri-agar alustalle ja varovasti kosketa sitä 2 – 3 kertaa vettä ennen kuin vesi on selvästi sameaa (Kuva 2).
- Liian monet bakteerit diassa voi johtaa alle-värinpoisto; liian vähän voi johtaa yli-värinpoisto.
3. Polta loput bakteerit rokotussilmukkaan., Jos veteen lisätään liikaa kulttuuria, et näe värjättyjä yksittäisiä bakteereja, eikä sinulla välttämättä ole luotettavaa Gram-tahraa.
4. Kun rokotussilmukka jäähtyy, levitä suspensio noin puolelle liukumäestä muodostaen ohuen kalvon (kuva 3).
5. Anna tämän ohuen suspension kuivua täysin (Kuva 4). Sivele on oltava täysin kuiva, ennen kuin liukumäki on lämpö kiinnitetty!
6., Lämpö-fix bakteerit dia,poimia ilmakuivattua dia peitinlasin pihdit ja pidä pohjassa liu ’ uta vastapäätä kokeena avaaminen lähellä microincinerator 10 sekunnin ajan (Kuva 5), kuten on osoitettu oma ohjaaja. Jos liukua ei kuumenneta tarpeeksi, kaikki bakteerit huuhtoutuvat pois. Jos se ylikuumenee, bakteerien rakenteellinen eheys voi vaurioitua.
b. tahra Huckerin kristallivioletilla minuutin ajan (Kuva 6). Pese varovasti vedellä (Kuva 7). Ravista ylimääräinen vesi pois, mutta älä läikytä kuiviksi vaiheiden välillä.
c., Tahraa gramman jodiliuoksella minuutin ajan (Kuva 8) ja pese varovasti vedellä.
d. Decolorize poimimalla liu ’ uta ja kerroit Gramma on decolorizer ajaa alas dia, kunnes violetti vain lakkaa virtaamasta alareunassa dia (Kuva 9).
- varmista, että koko kokeena on tasaisesti värittömäksi ja, että et ole alle-decolorizing tai yli-decolorizing.
- Pese välittömästi vedellä.
e. tahra safraniinilla minuutin ajan (Kuva 10)., Kun peset ylimääräisen safraniinin pois, pese varovasti ja lyhyesti, sillä osa bakteerissa olevasta sarfaniinista on mahdollista pestä pois.
f. Blot kuivaa ja tarkkaile käyttämällä öljykylpymikroskopiaa.
3. Varmista, että kaadat käytetyn väriaineen huolellisesti värjäyslevyllesi jäteaineen keräysastiaan, ei pesualtaaseen.
© Hussein Shoeb, kirjailija. Lisensoitu käytettäväksi, ASM MicrobeLibrary.
B., KAPSELI TAHRA
KESKUSTELUA
Monet bakteerit erittävät limaista, viskoosi, joka kattaa kutsutaan kapseli tai glycocalyx . Tämä koostuu yleensä polysakkaridista, polypeptidistä tai molemmista.
kyky tuottaa kapseli on perinnöllinen ominaisuus organismin, mutta pilleri ei ole välttämätön solujen osien. Kapseleita valmistetaan usein vain tietyissä kasvuolosuhteissa. Vaikka kapselit eivät ole välttämättömiä elämälle, ne auttavat bakteereita selviytymään luonnossa., Kapselit auttavat monia patogeenisiä ja normaaleja kasvibakteereja aluksi vastustamaan isännän fagosyyttisten solujen fagosytoosia. Maaperässä ja vedessä kapselit ehkäisevät bakteerien joutumista alkueläinten nielaisemiksi. Kapselit auttavat myös monia bakteereja tarttumaan pintoihin ja siten vastustamaan huuhtelua. Sen avulla myös monet bakteerit voivat muodostaa biofilmejä. A biofilm koostuu kerroksista bakteeri väestön kiinni isäntä-solujen ja upotettu yhteinen capsular massa.,
lisätietoja bakteeri-kapselit, ks. seuraavat Oppimisen Esineitä Luento-Opas:
- Glycocalyx (Kapseli) ja S-Kerros; Yksikkö 1, Kohta IIB4a
- Kyky Vastustaa Phagocytic Roihuava; Unit 3, Jakso B5b
ORGANISMI,
Rasvaton Maito liemi kulttuuri Enterobacter aerogenes. Skim maito toimittaa välttämättömiä ravintoaineita kapselin tuotantoon ja tarjoaa myös hieman tahraantuvan taustan.
MENETTELY (tehtävä erikseen)
1., Lietsoa Rasvatonta Maitoa liemi kulttuurin kanssa silmukka ja aseta 2-3 silmukoita Enterobacter aerogenes objektilasille.
2. Levitä näyte inokulaatiosilmukan avulla noin sentin paksuiseksi.
3. Anna sen kuivua täysin. Älä lämmitä. Kapselit tarttuvat hyvin lasiin, ja lämpö saattaa tuhota kapselin.
4. Tahraa kristallivioletilla minuutin ajan.
5. Pese ylimääräinen väriaine pois 20% kuparisulfaattiliuoksella.
6. Ravista ylimääräinen kuparisulfaattiliuos pois ja pyyhi välittömästi kuiviksi.
7. Tarkkaile käyttämällä öljykylpymikroskopiaa., Organismi ja liukumäellä kuivattu maito poimivat violetin väriaineen kapselin jäädessä värittömäksi.
8. Varmista, että kaadat käytetyn väriaineen huolellisesti värjäyslevyllesi jäteaineen keräysastiaan, ei pesualtaaseen.
9. Tarkkaile Streptococcus lactis-bakteerin esittelykapselitahraa , joka on kapseloitu bakteeri, joka on normaali kasvisto maidossa.
A. Gram-värjäys
Tehdä piirustuksia kunkin bakteerin teidän Gram-värjäys valmistelu.,
|
|
|
| Color = Gram reaction = Shape = |
Color = Gram reaction = Shape = Arrangement = |
B., Kapseli Tahra
Tehdä piirustus kapseli tahra valmistelu Enterobacter aerogenes ja esittelyn kapseli tahra Streptococcus pneumoniae.
Kapseli tahra
Streptococcus lactis
