Good Mood

Eredmények, Megbeszélés

Az Osztályába cdns könyvtár pszichológus segítségével a 35S-jelölt CaM-kötelező szűrés megközelítés leírt (24). Az egyik pozitív klón azonos nukleotidszekvenciát mutatott az atcat3-hoz az adatbázisban(GenBank csatlakozási szám. U43147). Annak bizonyítására, hogy az AtCat3 CaM-kötő fehérjét kódolt, az AtCat3 teljes kódolási régióját alcsoportosították a pET14b expressziós vektorba. A rekombináns AtCat3-at izopropil β-d-tiogalaktozid (IPTG) indukálta (ábra)., 1a), majd cam affinitással kromatográfiával közel homogenitásig tisztították. A CaM-kötő vizsgálathoz összesen baktériumkivonatot használtunk, és kimutatták, hogy a 35S-szel jelölt CaM Ca2+ (2.ábra) jelenlétében kötődik az AtCat3 fehérjéhez. 1A). Az EGTA hozzáadása után nem figyeltek meg CaM kötést. Ezenkívül a 35S-jelű CaM nem kötődik az AtCat3-hoz, amikor a CaCl2-t más kétértékű kationok váltották fel, mint például az MgCl2 vagy az MnCl2 (ábra. 1a), ami arra utal, hogy az Atcat3-hoz kötődő CaM Ca2 + – függő.

A CaM-kötési terület azonosításához az AtCat3-ban két C-terminális deléciós mutánst használtak a 35S-CaM-kötési vizsgálatokhoz. Jelenlétében 0.,2 mM Ca2+, CaM kötődik a vad típusú mutáns 1-451, míg CaM nem kötődik mutáns 1-414 (ábra. 1B), ami arra utal, hogy az AtCat3 CaM-kötő régiója a 415-451 aminosavakra korlátozódik. A CaM atcat3-hoz való kötődésének további megerősítése érdekében a CaM-val inkubáltuk a 415-451 AtCat3 aminosavnak megfelelő szintetikus peptidet. A peptid-CaM komplex kialakulását a nondenaturing PAGE értékelte. A 36 mer peptid képes stabil komplexet képezni a bütyökkel Ca2 + (ábra. 1C). Peptid hiányában egyetlen CaM sávot figyeltek meg., A peptidkoncentráció növekedésével egy másik, alacsony mozgékonyságú zenekar jelent meg, amely a peptid-CaM komplexet képviseli. Amikor a peptid és a CaM közötti mólarány 1:1 volt, csak a peptid-CaM komplex sávot észlelték, jelezve, hogy a peptidben csak egy CaM-kötőhely van. Nem peptid-CaM komplex alakult jelenlétében EGTA (ábra. 1C). Ezek az eredmények azt mutatják, hogy a CaM kifejezetten kalciumfüggő módon kötődik az AtCat3-hoz.

a kataláz szinte minden aerob szervezetben létezik. Az állatokban csak egy kataláz izoform van, amelyet egyetlen gén kódol., Ezzel szemben a növényekben a kataláz többszörös izoformaként van jelen, amelyet egy kis géncsalád (6, 26) kódol. Legalábbis ez igaz az olyan monocotokra, mint a kukorica és a kétszikűek, mint a dohány, az Arabidopsis és a sütőtök, amelyekben a kataláz jól jellemezhető. Érdekes módon mindegyiknek három izoformája van, amelyeket három gén kódol. Annak megállapításához, hogy az összes kataláz rendelkezik-e a CaM-kötő régiókkal, a gcg10 csomagban található pileup program segítségével összehasonlítottuk a 37 kataláz aminosav-szekvenciáit baktériumokból, állatokból és növényekből., Az aminosav szekvencia-összehasonlítás nagyon magas homológiát mutatott az N-terminal 384 aa-ban (körülbelül 60% hasonlóság és 50% identitás). Azonban a C-terminal 108 aa-ban, ahol a CaM-kötő régió található, nagyon kevés hasonlóság volt az AtCat3 és más nem növényi katalázok között (körülbelül 21% homológia és 14% identitás). Mindazonáltal az összes növényi kataláz magas homológiát mutatott ebben a részben (körülbelül 78% homológia és 70% identitás), különösen az AtCat3 CaM-kötési területének megfelelő régióban. Fig. 2 mutatja A C-terminál 108-aa szekvencia összehasonlítása 13 reprezentatív katalázok., Bár az aminosav-szekvenciák a jellemzett CaM-kötő fehérjék nem konzervált a CaM-kötő régióban, legtöbbjük egy másodlagos szerkezeti jellemzője, az alapvető amfifil α-helix (27), mint például az auxin-szabályozott fehérje zmsaur1 (24), valamint a növényi kiméra Ca2+/CaM fehérje kináz (28). Vegye figyelembe, hogy a CaM-kötő régiókban gyakran negatív töltésű aminosavak vannak, de a nettó töltés pozitív (16). A GCG programot használó spirális kerékvetítés alapján megállapítást nyert, hogy az AtCat3 438-451 aminosavai képesek egy alapvető amfifil α-helix kialakítására., Nyilvánvaló, hogy a spirális kerék egyik oldala hidrofób, a másik pedig hidrofil, nettó pozitív töltésekkel. Az atcat3 CaM-kötő régiójának megfelelő aminosav-szekvenciák elemzése megjósolta az alapvető amfifil α-helix létezését néhány más növényi katalázban. Érdekes módon a kukorica, a dohány, az Arabidopsis és a sütőtök három kataláz izoformája között legalább egy izoforma van az amfifil α-spirális szerkezettel minden fajban, például.,, tobacco1 (aminosavak 431-444), maize3 (aminosavak 442-455), valamint pumpkin1 (aminosavak 438-451), valamint Arabidopsis AtCat1 (aminosavak 438-451). Az, hogy minden növényfajra igaz-e, nem világos, mivel a genbankban más növényfajok katalázszekvenciái korlátozottak. A bakteriális és emlős katalázok kristályszerkezeti adatai alapján az α-helixek a katalázok C-terminális részének tipikus struktúrái (29), de a spirális kerékvetítés szerint ebben a részben nem létezik alapvető amfifilikus α-spirális szerkezet.,

annak vizsgálatára, hogy a CaM kötődik-e a planta tisztított katalázához, a dohánykatalázt durner és Klessig (10) alapján tisztították a levelekből. A tisztítási folyamat utolsó lépéseként egy CaM-Sefharose oszlopot használtunk. A kataláz tisztítási lépéseinek összefoglalását 1000 g dohánylevél felhasználásával az 1. táblázat tartalmazza. A dohánykatalázt az SDS/PAGE és az ezüstfestés alapján közel homogenitásig tisztítottuk (1.ábra). 3, 1. út). Kataláz identitás megerősítette nyugati blotting egy mAb ellen dohány kataláz (ábra. 3., 3. út)., A tisztított dohánykatalázhoz való CaM kötődést a következő megközelítések igazolták. i.a dohánykataláz tisztítására CaM-Szefaróz oszlopot használtak. Ennek a lépésnek a visszanyerési aránya 81% volt (1.táblázat), ami arra utal, hogy a dohánylevélből származó kataláz nagy része CaM-kötő fehérje. (ii)a tisztított katalázhoz való kötődés 0,2 mM-es CaCl2 (2. ábra) jelenlétében 35S címkével ellátott bütyköt használtunk. 3, 5. út). A rekombináns AtCat3-at kontrollként alkalmazták (1.ábra). 3., 2., 4. és 6.). Hozzáadása 0.,A 4 mM-es EGTA eltörölte a CaM kötődést, ami arra utal, hogy a CaM Ca2+-függő módon kötődik a növényi katalázhoz. CaM-kötő vizsgálatokat is végeztek annak meghatározására, hogy kötődik-e a gombához, a szarvasmarhához vagy a humán katalázhoz. Az eredmények azt mutatták, hogy ezen nem növényi katalázok egyike sem mutatott CaM-kötést (az adatok nem jelennek meg), ami összhangban van az aminosav-szekvencia-összehasonlításokkal (ábra. 2).,

A CaM-kötőhely vagy más jellemző CaM-kötő fehérjék szorosan egymás mellé helyezett régiói gyakran autoinhibitory vagy pseudosubstrate domainként működnek. Ez a régió inaktív állapotban tartja a célfehérjéket Ca2+ jel hiányában, például növényi kiméra Ca2+/CaM-függő protein kináz (30) és glutamát dekarboxiláz (31) esetén. A CaM növényi katalázokhoz való kötődésének jelentőségének vizsgálatához a rekombináns AtCat3 és a tisztított dohánykataláz katalitikus aktivitását CaCl2 és CaM jelenlétében és hiányában mérték., Hasonló kísérleteket végeztek más nem növényi katalázok alkalmazásával is. Az E. coli-rekombináns AtCat3-ban kifejezve nem mutatott aktivitást. Hasonló eredményeket kaptunk egy másik laboratóriumban (Zhixiang Chen, személyes kommunikáció). Ennek oka az lehet, hogy nem sikerült a rekombináns kataláz megfelelő szerkezetét kialakítani, mivel az aktív kataláz négy azonos vagy hasonló alegységből (6, 10, 26) álló tetramer. Ezzel szemben a tisztított dohánykataláz jelentős Ca2+/CaM-függő változást mutatott a tisztítási lépések során (1. táblázat)., A Ca2+/CaM stimuláló hatása minden lépésben körülbelül 2,2-szeres, kivéve a CaM-Szefaróz kromatográfia után kapott mintát. A kataláz aktivitás (2,5-szeres) nagyobb stimulációját mutatta, valószínűleg a nem Ca2 + / CaM-kötő kataláz frakció eltávolítása miatt (1.táblázat). A nem Ca2 + / CaM-kötő katalázfrakció specifikus aktivitása 59,6 egység (bazális aktivitás) volt. A Ca2 + / CaM azonban nem stimulálta a kataláz ezen frakciójának aktivitását (az adatok nem jelennek meg)., Ezek az eredmények azt mutatják, hogy a Ca2 + / CaM képes aktiválni a dohánykatalázt A Kam-Szefaróz kromatográfia után kapott frakcióban, amely megfelel a CaM-kötési eredményeknek. Ahhoz, hogy összehasonlítsuk a Ca2 + / CaM hatását a különböző forrásokból származó katalázok aktivitására, a relatív aktivitást használtuk, mivel jelentős különbség van a különböző fajokból származó katalázok specifikus aktivitásában. Például az A. niger kataláz specifikus aktivitása 5,7 egység; szarvasmarha májkataláz, 51,9 egység; humán eritrociták, 39,5 egység; dohánykataláz, 63.,1 egység (Ca2+/CaM hiányában). Fig. A 4a azt mutatja, hogy a CaCl2 önmagában vagy a CaM önmagában nem volt stimuláló hatással a dohánykataláz aktivitására (a maximális aktivitás körülbelül 40% – a). A Ca2+, CaM és Ca2+/CaM jelenlétében vagy hiányában nem figyeltek meg különbséget a katalitikus aktivitásban a gomba, a szarvasmarha vagy a humán katalázok között (1.ábra). 4A). A CaCl2 MgCl2-vel történő helyettesítésével a dohánykataláz aktivitásában nem volt jelentős változás a CaM jelenlétében vagy hiányában (az adatok nem láthatók)., A Ca2 + / CaM növényi kataláz aktivitásra gyakorolt hatásának további dokumentálásához minden egyes reakcióelegyhez 10 µM AtCat3 CaM-kötő régiónak megfelelő peptidet (415-451) adtunk. A nem növényi katalázokat nem befolyásolta a peptid hozzáadása. A Ca2+/CaM dohánykataláz aktivitásra gyakorolt stimuláló hatását azonban a peptid hozzáadásával eltörölték (ábra. 4A). Ezenkívül a peptidnek a dohánykataláz aktivitásra gyakorolt gátló hatása a peptid koncentrációjától függött (ábra. 4B)., A kataláz aktivitását körülbelül 58% gátolta, ami közel áll a kataláz alapaktivitásához. A peptid azonban nem volt hatással a szarvasmarha-kataláz aktivitására minden vizsgált koncentrációban (ábra. 4A). Ezek az eredmények arra utalnak, hogy a Ca2 + / CaM stimuláló hatással van a tisztított növényi katalázra, de nincs hatással a nem növényi katalázokra.

ismeretes, hogy a kataláz domináns peroxiszomális enzim, de létezik a mitokondriumokban és a citoplazmában is (32). Például a kukorica Cat3, amely az aminosav-szekvencia összehasonlításán alapuló CaM-kötő kataláz lehet, mitokondriális fehérje (33). Eredményeink (füge. 1-4) bizonyítsa, hogy a CaM kötődik a növényi katalázhoz, és szabályozza annak aktivitását. Ennek a szabályozási tevékenységnek az in vivo jelenlétének bizonyítására megvizsgáltuk, hogy a CaM együtt létezik-e a katalázzal a növények peroxiszómáiban., Az etiolált tökök sziklevon kivonataiból származó organellákat szacharózsűrűségű centrifugálással választottuk el. Távolítsa el a szennyeződés cytosolic fehérjék, hogy lehet jelen az oldatban, vagy csupán kapcsolódó peroxisomal membrán, az elszigetelt peroxisomes kezeltek proteináz K ily módon a peroxisomal fehérjék árnyékolva van a proteáz a peroxisomal membrán nem emésztett (34, 35). A peroxiszomális frakciók azonosságát a katalázaktivitás mérésével bizonyították (35)., CaM nagyon konzervált az egész királyságban (13-16), ezért nyugati elemzést végeztünk egy anti-humán CaM antitesttel. Kontrollként a rekombináns burgonya CaM PCM6-ot használták (ábra. 5, 3. út). Érdekes, hogy a PEROXISZOMÁLIS frakciókban a PCM6-hoz hasonló méretű sáv volt jelen,de az intenzitás lényegesen alacsonyabb volt a citoszolos CaM-hez képest (ábra. 5). Ezek az eredmények azt mutatják, hogy a CaM és a kataláz kolokalizálódik a peroxiszómákban. A CaM egy kis savas fehérje, amelyet elsősorban a citoplazmában fejeznek ki., A növényekben azonban kimutatták, hogy a CaM számos organellában jelen van, például a magban és a kloroplasztokban (36, 37) és az extracelluláris mátrixban (38). Továbbá, CaM-szabályozott fehérjék léteznek extracelluláris mátrix, mag, és kloroplasztok (38-40). Nem világos, hogy a CaM hogyan lép át a membránon. A legújabb tanulmányok azt mutatják, hogy a poszttranszlációs módosítások szerepet játszanak egyes CaM izoformák transzlokációjában. Például egy petunia CaM-szerű fehérje, a CaM53, a plazmamembránhoz kapcsolódik, amikor a fehérjét prenilálják. Ha a preniláció gátolt, a CaM53 elsősorban a magban található (41).,

tudomásunk szerint nincs olyan jelentés, amely a peroxiszómák kalciumkoncentrációját tárgyalná., A peroxiszóma biogenezisének nemrégiben módosított modellje alapján a peroxiszóma az endoplazmatikus retikulumból (ER) származik preperoxiszomális vezikulumok segítségével (42). Ismeretes, hogy az ER az intracelluláris kalciummedencék egyike. Így a peroxiszómák kalciumkoncentrációja olyan magas lehet, mint az ER-ben. A peroxiszomális kalciumkoncentráció mérése, valamint a citoplazmában a kalciumkoncentráció változása és a peroxiszóma közötti bármilyen kapcsolat ellenőrzése segít abban, hogy megértsük, hogyan szabályozza a Peroxiszomális katalázt a Ca2+/CaM., Például a szabad kalciumkoncentrációt a transzgenikus növényekben meg lehet mérni az elkészített aekorinnal, peroxiszóma-célzási jelzéssel. Az Aequorin egy kalciumérzékeny lumineszcens fehérje, amelynek lumineszcenciája közvetlenül jelenti a kalciumváltozást (43). Mivel a peroxiszóma egy olyan fő organelle, amely eltávolítja a mérgező ROS-t, elsősorban a H2O2-t, ésszerű feltételezni, hogy a peroxiszomális kataláz aktivitás egész idő alatt magas marad a H2O2 in situ gyors lebontására. A citoszolos kalcium ingadozása azonban jelentős hatással lehet A citoszolos kataláz aktivitására., Fontos hangsúlyozni, hogy nem minden kataláz CaM-kötő fehérje. Ezért további vizsgálatokra van szükség a Ca2 + / CaM jelentőségének a különböző organellák katalázaktivitásának szabályozásában.

a biotikus és abiotikus feszültségek Ca2 + beáramlást váltanak ki, a megnövekedett cytosolic Ca2+ stimulálja a H2O2 termelését, amely hírvivőként diffundál a környező sejtekbe, és kiváltja a fiziológiai választ (19, 20). Eredményeink azt sugallják, hogy a megnövekedett cytosolic Ca2 + csökkentheti a H2O2 szintet a Ca2+/CaM által közvetített kataláz aktivitás stimulálásával (ábra. 4)., Javasoljuk, hogy a megnövekedett cytosolic Ca2 + kettős szerepet játszik a H2O2 homeosztázis szabályozásában (ábra. 6): (i) pozitív rendelet generál H2O2 által közvetlenül aktiválása NADPH-oxidáz, amely affinitással Ca2+ (22), valamint közvetve termelő több NADPH útján Ca2+/CaM-szabályozott NAD-kináz (23); valamint (ii) negatív rendelet csökkenti a H2O2 által stimuláló kataláz aktivitás révén Ca2+/CaM moduláció (Fig. 4)., Jel-indukált változások Ca2+ átmenetileg eltérhet a gyakoriság, időtartam, amplitúdó, valamint a térbeli lokalizáció rezgések, valamint mód a térbeli terjedés, ami differenciál hatása a kalcium cél fehérjék (12, 44).