valódi erőfeszítést igényel, hogy a molekuláris és sejtbiológia alapvető ismereteit frissen tartsa, minden más mellett, amit meg kell tennie. Nem lenne jó, ha lenne egy hely, ahol könnyen olvasható cikkeket találhat, amelyek lehetővé teszik, hogy néhány perc alatt megtisztítsa ezeket az alapokat?
… remélem, azt mondta, “igen”, mert ez a cél az én “az alapokat:” cikksorozat, amit már, és továbbra is, hogy az Ön számára rendszeresen. Ez a cikk ismerteti a DNS-ligáció alapjait.,
A DNS ligációs haverja: DNS ligáz
DNS ligáz (EC 6.5.1.1) a DNS ligációs reakció középpontjában álló enzim. Kovalensen csatlakozik a DNS foszfát gerincéhez tompa vagy kompatibilis kohéziós végekkel (lásd az 1. ábrát), és természetes szerepe van a DNS-molekulák kettős száltöréseinek javításában. A molekuláris biológiában általában a restrikciós enzim által generált DNS-fragmensek vektoros gerincekbe történő beillesztésére használják. A kereskedelmi ligázok ATP-t és Mg2+ – t tartalmazó reakciópufferrel vannak ellátva, amelyek egyaránt nélkülözhetetlenek a ligáz aktivitásához., Mivel az ATP-t ismételt fagyasztási-olvadási ciklusok károsíthatják, tanácsos a puffer aliquotjait készíteni (lásd az “5 DNS-ligációs tipp”című cikkemet).
1.ábra. Összetartó és tompa végek, készen a DNS-ligációra!
A DNS ligációs reakció két lépése
a DNS ligációs reakciónak két alapvető lépése van. Először is, a DNS-végeknek véletlenül össze kell ütközniük, és elég hosszú ideig együtt kell maradniuk ahhoz, hogy a ligáz csatlakozzon hozzájuk. Ez a reakció leginkább nem hatékony része, de alacsony hőmérsékleten könnyebb. Miért?, Nos, amint valószínűleg tudni fogod, minden molekula gyorsabban mozog magasabb hőmérsékleten, így el tudod képzelni, hogy könnyebb lesz két DNS-végnek ütközni és együtt maradni, ha alacsony hőmérsékleten finoman lebegnek az oldaton, ahelyett, hogy felsőbb hőmérsékleten lennének. A kohéziós végekhez további ok van; az alacsonyabb hőmérsékletek stabilizálják a hidrogénkötést a komplementer nukleotidok között, ami valóban segít a dolgok helyén tartásában.
2.ábra., A DNS ligáció enzimes reakciója
a második lépés az enzimes reakció, amelyet vázlatosan mutatunk be a 2.ábrán.. A DNS-ligáz kétlépcsős mechanizmuson keresztül katalizálja a 3′-OH csatlakozását az 5′-foszfáthoz. Először is, az Amper nukleotid, amely az enzim aktív helyén lizinmaradékhoz kapcsolódik, az 5′-foszfátba kerül. Ezután az AMP-foszfát kötést megtámadja a 3 ‘ – OH, alkotó kovalens kötés és felszabadító AMP. Annak érdekében, hogy az enzim további reakciókat hajtson végre, az enzim aktív helyén lévő erősítőt ATP-vel kell feltölteni.,
Itt miért végző DNS Lekötésével alacsony hőmérsékleten segíthet
A DNS ligase enzim optimális tevékenység 25°C-on, így a ligálási reakció végzik a hőmérséklet, ami egy trade-off között az optimális hőmérséklet arra vonatkozóan, hogy a DNS-szálak együtt (1°C), valamint az enzimatikus reakció (25°C). Általában 1 óra 16°C-on rendben van, de mivel a DNS végeinek összekapcsolása a reakció legkevésbé hatékony része, amely ezt előnyben részesíti, ha a hőmérsékletet 4°C-ra csökkenti, még nagyobb hatékonyságot eredményezhet. Az enzim azonban nagyon lassan fog működni ezen a hőmérsékleten, így hosszú ideig (pl., egy éjszakán át) inkubációs idő szükséges.
eredetileg 2007.október 31-én jelent meg; 2014. December 5-én frissítve és újra közzétéve.
Ez segített neked? Akkor kérjük, ossza meg a hálózat.
