DISCUSSION
a Gram stain a bakteriológia legszélesebb körben alkalmazott festési eljárása. Ezt differenciálfoltnak nevezik, mivel különbséget tesz a Gram-pozitív és Gram-negatív baktériumok között. A Gram-festési eljárással lila foltot adó baktériumokat Gram-pozitívnak nevezik; azokat, amelyek rózsaszínűek, Gram-negatívnak mondják. A pozitív és negatív kifejezéseknek semmi közük az elektromos töltéshez, csupán két különböző morfológiai baktériumcsoportot jelölnek meg.,
a Gram-pozitív és Gram-negatív baktériumok sejtfaluk szerkezetének alapvető különbségei miatt különbözőképpen festenek. A bakteriális sejtfal arra szolgál, hogy a szervezet méretét és alakját, valamint az ozmotikus lízis megelőzését szolgálja. A bakteriális sejtfalban a merevséget biztosító anyag a peptidoglikán.
az elektronmikrográfokban a Gram-pozitív sejtfal széles, sűrű, 20-80 nm vastag falként jelenik meg, amely számos összekapcsolódó peptidoglikán rétegből áll (1a.és 1B. ábra). Kémiailag a Gram-pozitív sejtfal 60-90% – a peptidoglikán., A Gram-pozitív sejtfalban összefonódó teichoic savak. A sejtfalon keresztül és azon túl terjedő teikósavak glicerin, foszfátok és a cukoralkohol ribitol polimerjeiből állnak. Néhányuknak lipidje van (lipoteichoic sav). A peptidoglikán külső felülete olyan fehérjékkel van bevonva, amelyek különböznek a baktérium törzsétől és fajától.,
a Gram-negatív sejtfal viszont csak 2-3 réteg peptidoglikánt tartalmaz, és egy külső membrán veszi körül, amely foszfolipidekből, lipopoliszacharidból, lipoproteinből és fehérjékből áll (2a.és 2B. ábra). A Gram – negatív sejtfalnak csak 10%-20% – a peptidoglikán. A foszfolipidek elsősorban a külső membrán belső rétegében helyezkednek el, csakúgy, mint a lipoproteinek, amelyek a külső membránt a peptidoglikánhoz kötik., A külső membrán külső rétegében elhelyezkedő lipopoliszacharidok a membránba ágyazott lipid A nevű lipidrészből és a bakteriális felületről kifelé kinyúló poliszacharid részből állnak. A külső membrán számos olyan fehérjét is tartalmaz, amelyek különböznek a baktérium törzsétől és fajától.,
további információ a Gram-negatív, mind a Gram-pozitív sejtfal, a következő Tanulási Objektumok az Előadás Útmutató:
- A Prokarióta Sejt Fal; Egysége 1. Szakasz, IIB2
- A Gram-Pozitív sejtfal; Egysége 1, Szakasz IIB2a
- A Gram-Negatív sejtfal; Egysége 1, Szakasz IIB2b
A Gram-festés eljárás magában foglalja a négy alapvető lépéseket:
1. A baktériumokat először a crystal violet alapfestékkel festették. Mind a Gram-pozitív, mind a Gram-negatív baktériumok közvetlenül elszíneződnek, majd lila színűek lesznek e lépés után.,
2. A baktériumokat ezután Gram jódoldatával kezeljük. Ez lehetővé teszi, hogy a folt jobban megmaradjon oldhatatlan kristály lila-jód komplex kialakításával. Mind a Gram-pozitív, mind a Gram-negatív baktériumok lila maradnak e lépés után.
3. Ezután hozzáadjuk a Gram-színezéket, az etil-alkohol és az aceton keverékét. Ez a differenciál lépés. A Gram-pozitív baktériumok megtartják a kristály lila-jód komplexet, míg a Gram-negatív elszíneződés.
4. Végül a safranin ellennyomást (szintén alapfestéket) alkalmazzák., Mivel a Gram-pozitív baktériumok már lila színűek, az ellentámadás nem érinti őket. Gram-negatív baktériumok, amelyek most színtelen, válnak közvetlenül festett e szafranin. Így a Gram-pozitív lila, a Gram-negatív pedig rózsaszínű.
© Daniel Cavanaugh, Mark Keen, szerzők, Licensed for use, ASM MicrobeLibrary.,
a Gram-festés jelenlegi elméletével úgy gondolják, hogy a Gram-pozitív baktériumokban a kristálylila és a jód egy nagyobb molekulát alkot, amely kicsapódik a sejten belül. Az alkohol / aceton keverék ezután a többrétegű peptidoglikán kiszáradását okozza, ezáltal csökkentve a molekulák közötti teret, és ezáltal a sejtfal csapdába ejti a sejten belüli kristály ibolya-jód komplexet., Gram-negatív baktériumok esetében az alkohol/aceton keverék, amely lipid oldószer, feloldja a sejtfal külső membránját, és károsíthatja a citoplazmatikus membránt is, amelyhez a peptidoglikán kapcsolódik. A peptidoglikán néhány rétege nem képes megtartani a kristály ibolya-jód komplexet, a sejt elszíneződött.
fontos megjegyezni, hogy a Gram-pozitivitás (a lila kristály lila-jód komplex megtartásának képessége) nem minden vagy semmi jelenség, hanem fok kérdése., Számos olyan tényező van, amely Gram-pozitív organizmus Gram-negatív festését eredményezheti:
1. Az alkalmazott módszer és technikák. Túlmelegedés során hő rögzítés, több mint decolorization alkohollal, sőt túl sok mosás vízzel között lépéseket eredményezhet Gram-pozitív baktériumok elveszíti a kristály ibolya-jód-komplex.
2. A kultúra kora. A 24 óránál idősebb kultúrák elveszíthetik képességüket a kristály lila-jód komplex megtartására.
3. Maga a szervezet., Néhány Gram-pozitív baktérium jobban képes megtartani a kristály lila-jód komplexet, mint mások.
ezért nagyon pontos technikákat kell alkalmazni a Gram festésnél, és az eredményeket diszkrécióval kell értelmezni.
organizmusok
Tripticase szója agar lemez tenyészetek Escherichia coli (egy kis, Gram-negatív bacillus) és Staphylococcus epidermidis (egy Gram-pozitív kokcus staphylococcus elrendezéssel).
eljárás (külön kell elvégezni)
1., Escherichia coli
A. Heat-fix kenet Escherichia coli az alábbiak szerint:
1. A festéktartóban található ionmentesített víz csepegtető palackjának használatával helyezze a normál méretű csepp víz 1/2-ét egy tiszta csúszdára úgy, hogy megérinti a csepegtetőt a csúszdához (1.ábra). Gyakran használja a sterilizált oltási hurkot, hogy egy csepp ionmentesített vizet helyezzen a csúszdára.
2., Steril inokuláló hurok segítségével aszeptikusan távolítson el egy kis mennyiségű tenyészetet az agar felületéről, majd óvatosan érintse meg 2-3-szor a vízcsepphez, amíg a víz láthatóan zavarossá nem válik (2.ábra). A megfelelő mennyiségű baktériummal való jó kenet elengedhetetlen a Gram festéshez.
- túl sok baktérium a dián alul elszíneződést eredményezhet; túl kevés vezethet túl elszíneződéshez.
3. Égesse el a fennmaradó baktériumokat az inokuláló hurokon., Ha túl sok tenyészetet adunk a vízhez, akkor nem fog látni festett egyedi baktériumokat, és lehet, hogy nincs megbízható Gram foltja.
4. Miután az inokuláló hurok lehűlt, a szuszpenziót a csúszda körülbelül felére terítse, hogy vékony filmet képezzen. A helyesen elkészített kenetnek a megfelelő mennyiségű baktériummal hasonlónak kell lennie az ábrán. 3.
5. Hagyja, hogy ez a vékony szuszpenzió teljesen megszáradjon (4.ábra). A kenetnek teljesen száraznak kell lennie, mielőtt a csúszda felmelegszik!
6., A baktériumoknak a csúszdához való rögzítéséhez vegye fel a levegőn szárított csúszdát fedőcsipeszekkel, és tartsa a csúszda alját a kenettel szemben a mikrokinerátor nyílása közelében 10 másodpercig (5.ábra), amint azt az oktató is mutatja. Ha a csúszda nem elég meleg, az összes baktérium lemosódik. Ha túlmelegedett, a baktériumok szerkezeti integritása megsérülhet.
b. folt Hucker kristály ibolyával egy percig(6. ábra). Óvatosan mossa le vízzel(7. ábra). Rázza le a felesleges vizet, de ne szárítsa meg a lépések között.
c., Foltoljon Gram jódoldatával egy percig (8. ábra), majd óvatosan mossa le vízzel.
D. elszíneződés a csúszda felszedésével, majd hagyja, hogy a Gram színtelenítő futjon le a csúszdán, amíg a lila csak meg nem áll a csúszda alján (9. ábra).
- győződjön meg róla, hogy a teljes kenet egyenletesen elszíneződött, és hogy nem elszíneződött vagy túl elszíneződött.
- azonnal mossa le vízzel.
e. folt a szafraninnal egy percig(10. ábra)., Amikor lemossa a felesleges szafranint, legyen nagyon óvatos, hogy óvatosan, röviden mossa le, mert lehetséges, hogy mossa ki néhány sarfanin a baktériumban.
f. Blot száraz (11. Ábra), és megfigyeljük olajmerülő mikroszkóppal.
2. Staphylococcus epidermidis
A. Heat-fix kenet Staphylococcus epidermidis az alábbiak szerint:
1. A festéktartóban található ionmentesített víz csepegtető palackjának használatával helyezze a normál méretű csepp víz 1/2-ét egy tiszta csúszdára úgy, hogy megérinti a csepegtetőt a csúszdához (1.ábra)., Gyakran használja a sterilizált oltási hurkot, hogy egy csepp ionmentesített vizet helyezzen a csúszdára.
2. Steril inokuláló hurok segítségével aszeptikusan távolítson el egy kis mennyiségű tenyészetet az agar felületéről, majd óvatosan érintse meg 2-3-szor a vízcsepphez, amíg a víz láthatóan zavarossá nem válik (2.ábra).
- túl sok baktérium a dián alul elszíneződést eredményezhet; túl kevés vezethet túl elszíneződéshez.
3. Égesse el a fennmaradó baktériumokat az inokuláló hurokon., Ha túl sok tenyészetet adunk a vízhez, akkor nem fog látni festett egyedi baktériumokat, és lehet, hogy nincs megbízható Gram foltja.
4. Miután az inokuláló hurok lehűlt, a szuszpenziót a csúszda körülbelül felére terítse, hogy vékony filmet képezzen (3.ábra).
5. Hagyja, hogy ez a vékony szuszpenzió teljesen megszáradjon (4.ábra). A kenetnek teljesen száraznak kell lennie, mielőtt a csúszda felmelegszik!
6., A baktériumoknak a csúszdához való rögzítéséhez vegye fel a levegőn szárított csúszdát fedőcsipeszekkel, és tartsa a csúszda alját a kenettel szemben a mikrokinerátor nyílása közelében 10 másodpercig (5.ábra), amint azt az oktató is mutatja. Ha a csúszda nem elég meleg, az összes baktérium lemosódik. Ha túlmelegedett, a baktériumok szerkezeti integritása megsérülhet.
b. folt Hucker kristály ibolyával egy percig(6. ábra). Óvatosan mossa le vízzel(7. ábra). Rázza le a felesleges vizet, de ne szárítsa meg a lépések között.
c., Foltoljon Gram jódoldatával egy percig (8. ábra), majd óvatosan mossa le vízzel.
D. elszíneződés a csúszda felszedésével, majd hagyja, hogy a Gram színtelenítő futjon le a csúszdán, amíg a lila csak meg nem áll a csúszda alján (9. ábra).
- győződjön meg róla, hogy a teljes kenet egyenletesen elszíneződött, és hogy nem elszíneződött vagy túl elszíneződött.
- azonnal mossa le vízzel.
e. folt a szafraninnal egy percig(10. ábra)., Amikor lemossa a felesleges szafranint, legyen nagyon óvatos, hogy óvatosan, röviden mossa le, mert lehetséges, hogy mossa ki néhány sarfanin a baktériumban.
f. Blot száraz és megfigyelni segítségével olaj merítés mikroszkópia.
3. Ügyeljen arra, hogy a használt festéket óvatosan öntse a festőtálcába a hulladékfesték-gyűjtő tartályba, ne a mosogatóba.
© Hussein Shoeb, író. Engedélyezett használatra, ASM MicrobeLibrary.
B., A KAPSZULAFOLT
vita
sok baktérium nyálkás, viszkózus burkolatot választ ki, amelyet kapszulának vagy glicocalyxnek neveznek . Ez általában poliszacharidból, polipeptidből vagy mindkettőből áll.
a kapszula előállításának képessége a szervezet örökölt tulajdonsága, de a kapszula nem feltétlenül szükséges sejtkomponens. A kapszulákat gyakran csak meghatározott növekedési körülmények között állítják elő. Annak ellenére, hogy nem elengedhetetlen az élethez, a P kapszulák robosztusan segítik a baktériumokat a természetben való túlélésben., A kapszulák sok patogén és normál flóra baktériumnak segítenek abban, hogy kezdetben ellenálljanak a fagocitózisnak a gazdaszervezet fagocitikus sejtjei által. A talajban és a vízben a kapszulák segítenek megakadályozni, hogy a baktériumokat protozoánok elnyeljék. A kapszulák sok baktériumnak is segítenek tapadni a felületekhez, így ellenállnak az öblítésnek. Azt is lehetővé teszi, hogy sok baktérium biofilmeket képezzen. A biofilm a gazdasejtekhez tapadó, közös kapszulatömegbe ágyazott baktériumpopulációk rétegeiből áll.,
további információ a bakteriális kapszula, lásd a következő Tanulási Objektumok az Előadás Útmutató:
- A Glycocalyx (Kapszula), valamint az S-Réteg; Egysége 1, Szakasz IIB4a
- A Képessége, hogy Ellenáll a Fagocita Engulfment; Egység, 3. Szakasz B5b
a SZERVEZET
Sovány Tej húsleves kultúra Enterobacter aerogenes. A sovány tej alapvető tápanyagokat biztosít a kapszulák előállításához, valamint enyhén foltos hátteret biztosít.
eljárás (külön kell elvégezni)
1., Keverjük össze a sovány tejleves tenyészetét a hurokkal, majd helyezzük az Enterobacter aerogenes 2-3 hurkát egy mikroszkóp csúszdára.
2. Az oltási hurok segítségével terjessze ki a mintát, hogy lefedje a csúszda körülbelül egy hüvelykét.
3. Hagyja teljesen megszáradni. Ne melegítse fel a javítást. A kapszulák jól tapadnak az üveghez, a hő pedig elpusztíthatja a kapszulát.
4. Foltos kristály lila egy percig.
5. A felesleges festéket 20% – os réz-szulfát oldattal mossuk le.
6. Rázza le a felesleges réz-szulfát oldatot, majd azonnal szárítsa meg.
7. Figyelje meg az olajmerülő mikroszkópiát., A szervezet és a csúszdán szárított tej felveszi a lila festéket, míg a kapszula színtelen marad.
8. Ügyeljen arra, hogy a használt festéket óvatosan öntse a festőtálcába a hulladékfesték-gyűjtő tartályba, ne a mosogatóba.
9. Figyelje meg a Streptococcus lactis , egy kapszulázott baktérium demonstrációs kapszulafoltját, amely a tejben normális flóra.
A. a Gram-folt
rajzoljon rajzokat minden egyes baktériumról a Gram-foltkészítményen.,
|
|
|
| Color = Gram reaction = Shape = |
Color = Gram reaction = Shape = Arrangement = |
B., A Kapszulafolt
rajzolja meg az Enterobacter aerogenes kapszulafolt készítményét és a Streptococcus pneumoniae demonstrációs kapszulafoltját.
Streptococcus lactis
