mitokondriális DNS felfedezése
egyes fogalmak viharral veszik fel a tudományos világot, de mások csak sok összecsapás után hódítják meg. A mitokondriális DNS (mtDNA) felfedezése ebbe a második kategóriába tartozik. A biokémikusok, a hisztológusok és az elektronmikroszkóposok évek óta látták a DNS-t a mitokondriumokban, de többségük nem volt kész arra, hogy a DNS valóban ott legyen. Ez megmagyarázhatja, hogy az mtDNA tankönyvi beszámolói szinte soha nem mondják el, hogyan fedezték fel ezt a DNS-t.,
Miután az eukarióta sejt alapépítési tervét az 1950-es évek elején Palade, Sjöstrand és mások elektronmikrográfjai felfedték, a biokémikusok felkarolták de Duve dogmáját, hogy minden makromolekulának van egy, és csak egy intracelluláris helye. A sejtfrakciók elemzésekor a citokróm–oxidázt a mitokondriumok, a nikotianamid-adenin-dinukleotid-foszfát (NADPH) – citokróm C-reduktáz markereként vették figyelembe az endoplazmatikus retikulum, a DNS pedig a mag számára., Tekintettel erre a gondolkodásmódra, könnyű megérteni, hogy miért tulajdonították a DNS jelenlétét a mitokondriális frakciókban a nukleáris fragmensek szennyeződésének. A hisztokémiai DNS-foltok, mint például a Feulgen-reakció, szintén festették a trypanoszómák kinetoplasztjait és a rovar spermiumok “Nebenkernjét”, de abban az időben még nem ismerték fel, hogy ezek a struktúrák valójában szokatlan mitokondriumok., Hatalmas mennyiségű extranukleáris DNS-t fedeztek fel a kétéltű oociták citoplazmájában is, de sok évbe telt, hogy rájöjjünk, hogy ez a DNS valójában mtDNA, amelynek bősége tükrözi a hatalmas mennyiségű mitokondriumot ezekben a nagy sejtekben. 1961-ben, a Chicagói American Society of Cell Biology ötödik éves ülésén Hans Ris a mitokondriumok elektronmikrográfiáit mutatta be a baktériumok DNS-tartalmú nukleoidjaihoz hasonló zárványokkal, és az eretnek javaslatot tette arra, hogy a mitokondriumok (valamint a kloroplasztok) tartalmazzák saját DNS-jüket., A következő évben megjelent tanulmányban a RIS és Walter s Plaut tovább dokumentálta és bővítette ezeket a megfigyeléseket. Nem sokkal később több csoport biokémiai és morfológiai bizonyítékai megerősítették a DNS jelenlétét a kloroplasztokban.
A discovery chloroplast DNS készült biokémikusok vess egy új pillantást a korai megállapítások által Margaret Mitchell Boris Ephrussi, hogy bizonyos mutációk érintő mitokondriális funkció a penész Neurospora crassa a Saccharomyces cerevisiae élesztő nem örökölt szerint Mendel törvényei., Csábítónak tűnt feltételezni, hogy az ismeretlen “extrakromoszomális tényezők”, amelyek ezekben a mutációkban szerepet játszottak, valójában mtDNA.
1962-re az mtDNA fogalmának alapja így jól felkészült volt, de maga a koncepció nem volt általánosan elfogadott. Visszatekintve úgy tűnik, hogy a tudományos közösség meggyőző tanulmányokra várt, amelyek számos különböző módszerrel dokumentálták az mtDNA létezését.
az egyik ilyen vizsgálat a Stockholmi Egyetem Wenner Gren Intézetében dolgozó Margit MK Nass és Sylvan Nass elektronmikroszkópokból származott., Ezek azt mutatták, hogy a mátrix ozmium-fix csaj embrió mitokondrium található szál-mint zárványok, amelyek megjelenése után különböző rögzítési eljárások szorosan párhuzamosan, hogy a histone-ingyenes DNS nucleoid a baktériumok: rögzítés után a ozmium tetroxide, a felvételen megjelent összetapadt, valamint rúd átmérője ~400 Å; rögzítés, a szövetek, a ozmium tetroxide követi kezelés uranyl-acetát, mielőtt a kiszáradás tette őket jelenik meg, mint 15-30-Å vékony szálak., Még meggyőzőbb bizonyíték a DNS jelenlétére ezekben a zárványokban az volt a megfigyelés, hogy a zárványok eltávolíthatók az enyhén rögzített embrionális szövet Dnázzal történő kezelésével. A pepszinnel, Rnázzal vagy Dnázmentes puffervezérléssel végzett kezelés hatástalan volt. Ezeknek az elektronmikrográfoknak a tisztasága és a gondos kontrollok, amelyek benne voltak, lenyűgöző hatással voltak a sejtbiológusokra. Az MMK Nass és az S Nass a Journal of Cell Biology 1963-as számában jelent meg két back-to-back folyóiratban., Abban az időben azonban a sejtbiológia és a biokémia még mindig meglehetősen eltérő tudományágak voltak, és a legtöbb biokémikus nem olvasta el a sejtbiológiának szentelt folyóiratokat. Ezért eltart egy ideig, amíg az MMK nass és S Nass megállapításai bekerültek a biokémiai közösség tudatába.
körülbelül ugyanabban az időben, Ellen Haslbrunner, Hans Tuppy, és Schatz a Biokémiai Intézet a University of Vienna próbálták megtalálni a biokémiai alapja az extrakromoszomális mutációk, amelyek megszüntették a légzésfunkció az élesztő S. cerevisiae., Az 1960-as évek elején sok biokémikus még mindig vonakodott az élesztő “légzőgranulátumát” jóhiszemű mitokondriumnak tekinteni, amely Haslbrunner et al. nos kívül a mainstream mitokondriális biokémia az Egyesült Államokban és máshol.
a mitokondriumokban a DNS kereséséhez biokémiai megközelítést választottak. Az élesztő mitokondriumokat a rendelkezésre álló legjobb módszerekkel tisztítottuk, DNS-tartalmukat pedig az időszerű “Diesche” színreakcióval mértük., Néhány évvel korábban, de Duve, valamint munkatársai kimutatták, hogy a centrifugálással frakciók lehetséges, hogy az egyensúly sűrűség grádiens gyakran adott egy tiszta elkülönítése különböző, egyrészt. Meglepő, hogy a szokásos szacharóz gradiens nem külön élesztő mitokondriumok a nukleáris töredékek, de amikor szacharóz helyébe az X-ray kontrasztos ügynök ‘Urografin’, a mitokondriumok kialakult egy rendkívül éles zenekar, valamint a DNS-e volt jelen, csak a két frakció: a legtöbb volt az alján, a centrifuga cső, egy nagyon kis összeg, de különálló csúcs pontosan egybeesett azzal, hogy a mitokondriumok., Az alsó frakcióban lévő DNS-t könnyen emésztette a DNase, és nyilvánvalóan nukleáris DNS-t képviselt. A mitokondriális frakcióban lévő DNS-t nem emésztette fel könnyen a DNáz, kivéve, ha az organellákat először triklór-ecetsavval megszakították; feltehetően a mitokondriális membránok által zárt DNS-t képviselte. Koncentrációja nagyon állandó volt a különböző kísérletek között−1-4 µg mg-1 mitokondriális fehérje között. A patkánymájból, patkány veséből és szarvasmarhák szívéből származó Urografin – tisztított mitokondriumok csaknem 10-szer kevesebb DNS-t tartalmaztak, 0,2-0,6 µg DNS / mg fehérje között., A tipikus emlős mitokondriont úgy számítottuk ki, hogy 3 × 10-17 G DNS-t tartalmaz. Feltételezve, hogy a DNS kettős szálú, legfeljebb 1,2 MDa polipeptidláncot képes kódolni. Ezt az eredményt fontosnak tartották, mert határozottan kizárta annak lehetőségét, hogy az mtDNA kódolja az összes mitokondriális fehérjét. Ma ez a korai számítás Haslbrunner et al. több okból is megtámadható, mégis rendkívül közel került a valósághoz: az emlős mtDNA által kódolt 13 polipeptid teljes tömege 0.,423 MDa, a fennmaradó kódolás potenciális nagyrészt át gének a ribosomal, majd transzfer Rns, valamint az a tény, hogy a mitokondriumok általában több, mint egy példányát a DNS genom.
