wyniki
nieleczonych próbek. Zauważamy, że nawet w nieutwardzonych próbkach różnice między kroplami wody i oleju (rys. 1 B I C) lub pomiędzy różnymi składnikami komórki (rys. 1D) generują wystarczający kontrast, aby je rozróżnić. W komórkach wyższe-Z materiały, takie jak sole, fosfor i żelazo, które mogą być skoncentrowane w różnych regionach, mają tendencję do poprawy kontrastu. Rys., 1D pokazuje nieleczoną komórkę jajnika chomika chińskiego (CHO) w normalnym pożywce hodowlanej w temperaturze pokojowej. Zarys komórki i jądro z jego wewnętrzną strukturą są wyraźnie widoczne, podobnie jak szereg ciemnych, kulistych cząstek w cytoplazmie. Identyfikacja tych cząstek jako kropelek lipidowych jest omówiona poniżej.
barwienie metali ciężkich. Granice rozdzielczości i kontrastu podczas obserwacji materiałów o niskiej zawartości Z sugerują, że znaczne korzyści można osiągnąć poprzez barwienie komórek markerami o wysokiej zawartości z, takimi jak plamy o gęstości elektronowej lub nanocząsteczkowe złote etykiety., Rzeczywiście, jesteśmy w stanie wykryć złote kulki w wodzie o średnicy do 10 nm za pomocą ultracienkich membran (dane nie są pokazane).
różnicowe barwienie organelli wewnątrz komórek przy użyciu materiałów elektrondense jest standardem w technice EM, chociaż zwykle nie stosuje się do SEM. Rys. 2 pokazuje bogatą różnorodność struktur wewnątrz hodowanych komórek, które były hodowane bezpośrednio na błonie przegrodowej, a następnie utrwalane i barwione octanem uranylu (8). Wewnątrzkomórkowe organelle są wyraźnie widoczne, w tym wewnętrzne szczegóły mitochondriów (rys. 2C ), włókna naprężeniowe aktyny (rys., 2D) oraz złożonych struktur kanalikowych i cytoszkieletowych (rys. 2 A i B). Wyższa energia wiązki na Rys. 2C sondy struktury wewnętrznej, podczas gdy w niższej energii (rys. 2D ), powierzchnia blisko membrany jest wizualizowana. W ten sposób różne energie mogą być wykorzystane do uzyskania informacji trójwymiarowej.
obrazowanie zabarwionych komórek. Gwiazdki oznaczają jądra, a cienkie strzałki oznaczają mitochondria. A) komórki HeLa wyhodowane na błonie w pożywce normalnego wzrostu, następnie utrwalone paraformaldehydem i zabarwione octanem uranylu (zobrazowane przy 12 kV)., B) powiększenie zaznaczonego prostokąta pokazanego w A. C) ogniwo CHO zamocowane aldehydem glutarowym i paraformaldehydem, zabarwione octanem uranylu i utrzymywane w wodzie (zobrazowane przy 30 kV). Gruba strzałka oznacza mitochondrion, który otacza kroplę lipidową. (Inset) większe powiększenie pokazujące mitochondria (cienkie strzałki). D) włókna Aktynowe w barwionych komórkach CHO. Leczenie i obrazowanie są opisane dla A.
Nanocząsteczkowe markery Złota. Wysoką rozdzielczość i swoistość wykrywania można osiągnąć poprzez wiązanie przeciwciał lub innych ligandów., Podobnie jak w przypadku innych metod EM, etykietowanie odbywa się najwygodniej za pomocą nanocząstek złota. W przeciwieństwie do transmisji EM (TEM), która pobiera tylko bardzo cienkie i często dowolne sekcje, wet sem umożliwia szybkie przełączanie między lokalnym i globalnym widokiem etykietowania w całej komórce. Rys. 3 A i B pokazują, w jaki sposób 40-nm nanocząsteczki złota znakowane monoklonalne przeciwdepresyjne receptory czynnika wzrostu naskórka receptory na nienaruszonych komórkach nowotworowych A431., Utrwalanie jest często przydatne i wygodne nawet w mokrych warunkach SEM i może ułatwić etykietowanie, a także przenoszenie do mikroskopu. Przedstawione tutaj komórki są również zabarwione octanem uranylu, co umożliwia wyrównanie oznakowanych receptorów z ogólną strukturą komórek. Wysoki kontrast i jednolity rozmiar nanocząstek umożliwiają jednoznaczną identyfikację i lokalizację. Znajomość dokładnej lokalizacji pojedynczych cząsteczek receptora otwiera możliwość pomiaru zdarzeń, takich jak dimeryzacja receptora indukowana przez naskórkowy czynnik wzrostu., Barwienie komórek nie jest potrzebne do etykietowania ,a my zawarliśmy obraz nieutwardzonych, oznakowanych komórek (rys. 7, które są publikowane jako informacje uzupełniające na stronie internetowej PNAS). Pokazano również obraz pokazujący, że możliwe jest oznaczanie wewnętrznych części komórki (rys. 8, która jest publikowana jako informacje uzupełniające na stronie internetowej PNAS), w tym przypadku znakowanie mitochondriów złotymi koralikami. Znakowanie włókien aktynowych wewnątrz komórek zostało również osiągnięte za pomocą subnanometrowych cząstek złota, a następnie srebra (DANE nie pokazano).
obrazowanie nanocząstek złota na komórkach. Groty strzałek oznaczają nanocząstki złota. A) receptory naskórkowego czynnika wzrostu immunolabeled z 40-nm nanocząstek złota na komórkach A431 i przeciwstarzeniowe z octanem uranylu (zobrazowane przy 30 kV). (B) powiększenie zaznaczonego prostokąta pokazanego w E. (C) domniemane receptory gastryny dla bakterii H. pylori, po inkubacji z skompletowaną biotynilowaną gastryną na cząsteczkach złota pokrytych streptawidyną o długości 20 nm, a następnie aldehyd glutarowy i sedymentacja na błonie pokrytej Poli – (L-lizyna) (zobrazowane przy 20 kV).,
przykład złotego oznakowania bakterii podano na Rys. 3C . Tutaj domniemany receptor gastryny Helicobacter pylori (9) jest wykrywany przez inkubację z kompleksami biotylowanej gastryny i pokrytych streptawidyną nanocząstek złota o długości 20 nm. Podawanie biotylowanej gastryny wcześniej niż złota pokrytego streptawidyną nie dawało prawie żadnego przywiązania nanocząstek do bakterii. Wynik ten został uzyskany niezależnie od czasu pomiędzy dwoma etapami, co sugeruje, że wychwyt gastryny do H. pylori jest prawie natychmiastowy., Fakt, że kompleksowana gastryna nie dostała się do komórek wskazuje na możliwość określenia granic wielkości cząstek, które mogą być internalizowane przez bakterie.
porównanie technik obrazowania (Trypanosoma brucei). Warto porównać tę technologię z istniejącymi technikami obrazowania przy użyciu systemu pojedynczego modelu. Takie badanie jest szczegółowo opisane na Rys. 4, używając formy procyklicznej pasożyta T. brucei, która rozmnaża się w śródpleczu muchy tse. Pierwsze trzy obrazy pokazują istniejące tryby obrazowania: optyczna mikroskopia fluorescencyjna (rys., 4A), mikroskopia różnicowego kontrastu interferencyjnego (rys. 4B) i TEM (rys. 4C). Siła istniejących technik jest widoczna: miejscowe znakowanie w fluorescencji i szczegółowe sekcje w TEM. Nieleczona optyczna (rys. 4B) i wet-SEM (rys. 4D) obrazy wyznaczają granice komórki, ale mają niski kontrast i brak szczegółów. Oba podkreślają jądro, ale inne organelle, które pojawiają się w obrazie różnicowego kontrastu interferencyjnego, nie są wyraźnie zidentyfikowane, podczas gdy obraz wet-SEM wydobywa krople lipidów na korzyść. Barwienie tetroksydowe osmu (rys., 4E) nie jest tak przydatny w tym systemie, podkreślając głównie kropelki lipidowe i niektóre niezidentyfikowane organelle wewnętrzne. Najsilniejsze obrazowanie widać na Rys. 4F, do którego zastosowano barwienie octanem uranylu. Zaletą nienaruszonego obrazowania, z którym można zobaczyć pełną komórkę (wraz z jej drobnych struktur wewnętrznych, które mogą być obserwowane w szczegółach)jest oczywiste, zwłaszcza w porównaniu do obrazowania TEM (rys. 4C). Wreszcie, wet-sem zobrazowanie całokomórkowego specyficznego znakowania z przeciwciałami przeciwko głównym glikozylofosfatydyloinozytol zakotwiczone powierzchniowe białko EP procykliny (10)pokazano na ryc., 4 G I H . Co ciekawe, wiadomo, że EP procyklina pokrywa całą komórkę równomiernie, ale obserwowany sygnał jest grupowany. Przypisujemy to tendencjom leżących u podstaw tratw lipidowych do klastrowania pod wpływem przeciwciał, procesowi, któremu fiksacja w formaldehydie nie jest w stanie zapobiec. Złote znaczniki wyjaśniają również trójwymiarową konformację komórki w sposób przypominający standardowy obraz SEM (doskonały, reprezentatywny obraz sem T. brucei można znaleźć na http://tryps.rockefeller.edu/crosslab_intro.html).
obrazowanie multimodalne T. brucei., Typowa długość komórki wynosi 20 µm długości i 3 µm szerokości. A) konfokalna mikroskopia fluorescencyjna. Zastosowano przeciwciała anty-EP procykliny (Cedarlina), a wiązanie wykryto za pomocą anty-mysich związków z izotiocyjanianem fluoresceiny (zielony). Zabarwienie jądra i kinetoplastu było jodkiem propidium (czerwony). B) obrazowania optycznego (różnicowego kontrastu interferencyjnego). C) części TEM komórki, a następnie zabarwienie octanem uranylu, odsłaniające organelle wewnętrzne. D) zobrazowanie mokre-SEM całych, uwodnionych, nieutwardzonych komórek. E) zgodnie z Opisem dla D z zastosowaniem barwienia tetroksydowego osmu., F) zgodnie z Opisem dla D z zastosowaniem barwienia octanem uranylu. G) nanocząsteczkowe markery złota związane z przeciwciałami przeciw mysim, pokazujące położenie powierzchniowego białka EP procykliny i umożliwiające jednocześnie trójwymiarowy widok. (H) większe powiększenie środkowej części komórki pokazanej w G, wyjaśniające obszar trójwymiarowej helicity w komórce.
oczywiście TEM będzie miał lepszą rozdzielczość, ogólnie, niż wet SEM, ale obrazy przedstawione na przykładzie T. brucei dla porównania są „typowymi” obrazami uzyskanymi w tym samym laboratorium., Ponieważ wet SEM różni się w swojej użyteczności niż tem i mikroskopii optycznej, w T. brucei może być postrzegana jako ważna komplementarna zdolność, i można oczekiwać, że pełny obraz byłby podany przez kombinację techniki optycznej, TEM i wet-sem.
Mokry SEM może być stosowany do grubych próbek, takich jak fragmenty tkanek, po prostu mocując próbkę do membrany. Ograniczona głębokość próbkowania BSE umożliwia obrazowanie „Wirtualnego odcinka”, rozciągającego się od powierzchni do określonej głębokości do kilku mikrometrów bez potrzeby cienkiego cięcia.,
rys. 5 A i B pokazuje bezpośrednią wizualizację nieleczonych tkanek z myszy. Rys. 5A to obraz o małym powiększeniu tkanki serca. Organizacja komórek mięśniowych jest widoczna. Powiększenie jednej komórki (rys. 5B) daje żywy obraz jądra i wewnątrzkomórkowych organelli, ewentualnie mitochondria, i ich dyspersji w komórce. Jak pokazano powyżej dla hodowanych komórek, barwienie tkanek jest korzystne, ale nie konieczne i może poprawić wizualizację wielu cech. Rys. 5 C i D pokazuje obszar kory nerkowej szczura., Barwienie (żelazicyjanek potasu) podkreśla ogólną organizację i kontakty komórkowe w obrębie nabłonka kanalików nerkowych. Staranne dostosowanie warunków barwienia i obrazowania może ujawnić różne i uzupełniające się informacje, takie jak architektura tkanek; np. tkanki zabarwione octanem uranylu dają wyraźny obraz macierzy zewnątrzkomórkowej (dane nie są pokazane).
obrazowanie tkanek. A) serce myszy, nieleczone, obrazowane bezpośrednio w uchwycie próbki przy napięciu 30 kV. B) większe powiększenie prostokąta pokazanego w A., (C) nerkę szczura wycięto, wycięto i zamocowano w formalinie przez 24 h. następnie tkankę zabarwiono 0,1% octanem uranylu przez 10 min. C i D wykazują komórki nabłonkowe wewnątrz wewnętrznej powierzchni kanalików promieni rdzeniowych. Siatka podtrzymująca membranę jest widoczna na zdjęciu. D) powiększenie pola pokazanego w C.
jednoczesna Kolekcja fotonów (CL). Wykrywanie BSE w mokrym SEM może być uzupełnione równoczesnym gromadzeniem fotonów., Skanująca wiązka elektronów wzbudza cząsteczki w próbce, które następnie mogą emitować światło o charakterystycznych długościach fal (CL). Natężenie światła jest następnie wykorzystywane do uzyskania obrazu rozkładu cząsteczek scyntylacyjnych, endogennych do komórki lub etykiet, które mogą być wprowadzane na zewnątrz. Obraz ten otrzymuje się równocześnie z obrazowaniem przez BSE w rozdzielczości ograniczonej oddziaływaniami elektron–Materia, a nie przez dyfrakcję światła (6). W płynie pod próbką umieściliśmy prowadnicę światła, która kieruje emitowane światło na fotopowielacz., Taka konfiguracja zapewnia dobre sprzężenie i efektywne zbieranie fotonów wzbudzonych wiązką elektronów bez uszczerbku dla skuteczności jednoczesnego wykrywania BSE.
rys. 6 pokazuje nieleczone komórki CHO, wizualizowane jednocześnie przez BSE i fotony. Na Rys. 6A, granice komórek są wyraźnie zarysowane w trybie obrazowania elektronów, a jądro (wraz z jego jądrami) są widoczne, podobnie jak ciemne plamy ≈1-µm wokół jądra. Pojawiają się one w cytoplazmie wszystkich komórek eukariotycznych, które badaliśmy, i chociaż ich liczba jest różna, zwykle są rozproszone wokół jądra., Na zdjęciu CL pokazanym na Rys. 6B, zarys komórki i jądro są jasno określone, co wskazuje na rozkład cząsteczek scyntylacyjnych (podobnych do autofluorescencji) w komórce. W tym trybie te same plamy charakteryzują się wysoką emisją fotonów. Połączenie wysokiego sygnału katodoluminescencyjnego i wysokiej zawartości węgla jest typowe dla kropelek lipidowych (11), które uczestniczą w magazynowaniu energii w ogniwie (12)., Niezależny test dodawania kwasu oleinowego 200 µM spowodował silną proliferację tych kropelek w komórce( dane nie pokazano), zgodnie z założeniem, że obserwowane plamki to kropelki lipidowe.
jednoczesne obrazowanie z fotonami wzbudzonymi wiązką elektronów (CL). (A) Unstained cho cell, imaged by using BSE as described for Fig. 1D . B) obraz światła emitowanego wykonany jednocześnie z obrazem przedstawionym w A.,
mokry SEM ma przewagę nad standardowymi technikami sem w konserwacji lipidów, szczególnie w dużych agregatach, takich jak krople lipidów. Wyeliminowanie potrzeby suszenia oszczędza lipidy z rozpuszczalników organicznych, które mogą je rozpuszczać. Chociaż obróbka osmu zachowa niektóre dwuwarstwy lipidowe, w większych agregatach OSM szybko reaguje, tworząc zewnętrzną skorupę, która nie wpuszcza osmu, pozostawiając Agregaty podatne na późniejszą obróbkę rozpuszczalnikiem organicznym., W preparatach kriogenicznych skłonność procesu dekoltu do pękania wzdłuż granic lipidowo-wodnych jest również zagrożeniem dla dużych struktur lipidowych.
obrazowanie markerów w wysokiej rozdzielczości jest wysoce pożądaną funkcją trybu detekcji CL, wymagającą opracowania etykiet dla określonych cząsteczek w komórkach. Na Rys. 9, który został opublikowany jako informacje uzupełniające na stronie internetowej PNAS, wykazujemy, że standardowe fluorescencyjne kulki o średnicy 0,2 µm emitują intensywnie fotony pod wiązką elektronów i mogą być obrazowane z rozdzielczością ≈100 nm (7)., Obrazowanie mniejszych kulek jest ograniczone niską jasnością, co pociąga za sobą rozwój wyspecjalizowanych kulek scyntylacyjnych o małej średnicy . Ponieważ mechanizm wzbudzania scyntylacji jest najsilniejszy, gdy wiązka bezpośrednio uderza w koralik, spodziewamy się, że może to rozszerzyć rozdzielczość obrazowania fluorescencyjnego o rząd wielkości poza dostępną w mikroskopii optycznej.
