descoperirea ADN-ului mitocondrial
unele concepte iau lumea științifică prin furtună, dar altele o cuceresc numai după multe derapaje. Descoperirea ADN-ului mitocondrial (mtDNA) aparține acestei a doua categorii. Biochimiștii, histologii și microscopiștii electronici au văzut ADN-ul în mitocondrii de ani de zile, dar majoritatea nu erau pregătiți pentru ideea că ADN-ul aparținea cu adevărat acolo. Acest lucru poate explica de ce conturile manuale ale mtDNA aproape niciodată nu spun cum a fost descoperit acest ADN.,
După construcție de bază planul de celule eucariote, a fost descoperit la începutul anilor 1950 de către micrografii electronice de Palade, Sjöstrand, și altele, biochimisti îmbrățișat de Duve dogma că fiecare macromoleculă avut unul, și numai unul, intracelular locație. În analiza fracțiunilor celulare, citocrom oxidaza a fost luată ca marker pentru mitocondrii, nicotianamidă adenină dinucleotidă fosfat (NADPH)–citocrom C reductază pentru reticulul endoplasmatic și ADN pentru nucleu., Având în vedere acest cadru de spirit, este ușor de înțeles de ce prezența ADN-ului în fracțiunile mitocondriale a fost, în general, atribuită contaminării cu fragmente nucleare. Histochimic ADN-ul pete, cum ar fi reacția Feulgen, de asemenea, colorate kinetoplasts de Trypanosomes și ‘Nebenkern’ de insecte spermatozoizi, dar la acel moment nu a fost încă recunoscut faptul că aceste structuri au fost, în fapt, neobișnuit mitocondrii., Cantități masive de ADN extranuclear au fost, de asemenea, detectate în citoplasma ovocitelor amfibiene, dar a durat mulți ani pentru a realiza că acest ADN a fost, de fapt, mtDNA a cărui abundență reflecta cantitatea enormă de mitocondrii din aceste celule mari. În 1961, la cea de-a Cincea Reuniune Anuală a Societății Americane de Biologie Celulară din Chicago, Hans Ris arătat micrografii electronice de mitocondrii cu incluziuni asemănătoare ADN-conțin nucleoizii de bacterii și a făcut eretice propunere care mitocondriile (și, de asemenea, cloroplaste) conține ADN-ul propriu., Într-o lucrare care a apărut în anul următor, RIS și Walter s Plaut au documentat și extins aceste observații. Curând după aceea, dovezile biochimice și morfologice din mai multe grupuri au confirmat prezența ADN-ului în cloroplaste.
descoperirea de cloroplast dna a făcut biochimisti ia o privire proaspătă la începutul constatările de Margaret Mitchell și Boris Ephrussi că anumite mutații care afectează funcția mitocondrială în matriță Neurospora crassa și drojdie Saccharomyces cerevisiae nu au fost moștenit în conformitate cu legile lui Mendel., Părea tentant să speculăm că „factorii extrachromozomali” necunoscuți implicați în aceste mutații au fost, de fapt, mtDNA.până în 1962, terenul pentru conceptul de mtDNA a fost astfel bine pregătit, însă conceptul în sine nu a fost în general acceptat. În retrospectivă, se pare că comunitatea științifică aștepta studii convingătoare care documentau existența mtDNA prin mai multe metode diverse.unul dintre aceste studii a venit de la microscopii electronici Margit Mk Nass și Sylvan Nass, care lucrau apoi la Institutul Wenner Gren al Universității din Stockholm., Ei au arătat că matricea de osmiu-fix embrionare de pui de găină mitocondriile cuprinse thread-cum ar fi incluziuni căror apariție după diferite reparații, proceduri strâns egalate de histone-gratuit ADN în nucleoid de bacterii: după fixare cu tetraoxidul de osmiu, incluziuni apărut grupuri de granulat și baruri, cu un diametru de ~400 Å; repararea țesuturilor cu tetraoxidul de osmiu, urmat de tratament cu acetat de uranil înainte de deshidratare le-a făcut apărea ca 15-30-Å fibre subțiri., O dovadă și mai convingătoare pentru prezența ADN-ului în aceste incluziuni a fost observația că incluziunile ar putea fi îndepărtate prin tratarea țesutului embrionar ușor fixat cu Dnază. Tratamentul cu pepsină, cu Rnază sau cu controale tampon fără Dnază a fost ineficient. Claritatea acestor micrografii electronice și controalele atente care au fost incluse au avut un impact convingător asupra biologilor celulari. MMK Nass și s Nass și-au publicat lucrările în două lucrări back-to-back într-un număr din 1963 al Journal of Cell Biology., La acea vreme, însă, biologia celulară și biochimia erau încă discipline destul de diferite, iar majoritatea Biochimiștilor nu au citit reviste dedicate biologiei celulare. Prin urmare, a durat ceva timp înainte ca rezultatele MMK Nass și s Nass să intre în conștiința comunității biochimice.
La aproximativ în același timp, Ellen Haslbrunner, Hans Tuppy, și Schatz la Institutul de Biochimie de la Universitatea din Viena au fost încercarea de a găsi un biochimice de baza pentru extrachromosomal mutații care a abolit funcția respiratorie în drojdia S. cerevisiae., La începutul anilor 1960, mulți biochimiști erau încă reticenți în a considera „granulele respiratorii” ale drojdiei ca mitocondrii de bună credință, care au plasat cercetarea lui Haslbrunner et al. Ei bine, în afara mainstream de biochimie mitocondriale în Statele Unite și în altă parte.pentru a căuta ADN în mitocondrii, a fost aleasă o abordare biochimică. Mitocondriile de drojdie au fost purificate prin cele mai bune metode disponibile, iar conținutul lor de ADN a fost măsurat prin reacția de culoare „diesche” onorată în timp., Cu câțiva ani înainte, de Duve și colegii au arătat că centrifugarea fracțiilor subcelulare la echilibru într-un gradient de densitate a dat adesea o separare curată a diferitelor organele. În mod surprinzător, de obicei zaharoză degradeuri nu a separat de drojdie mitocondriile din fragmente nucleare, dar când zaharoză a fost înlocuit cu X-ray contrast agent ‘Urografin’, mitocondriile formează un extrem de ascuțit trupa, și ADN-ul a fost prezent doar în două fracțiuni: cel mai mult a fost la partea de jos a tubului de centrifugare, și o cantitate foarte mică, dar discrete de vârf a coincis exact cu aceea a mitocondriilor., ADN-ul din fracțiunea de jos a fost ușor digerat de DNase și aparent a reprezentat ADN nuclear. ADN-ul din fracțiunea mitocondrială nu a fost ușor digerat de Dnază, cu excepția cazului în care organele au fost mai întâi perturbate cu acid tricloroacetic; probabil, a reprezentat ADN-ul închis de membranele mitocondriale. Concentrația sa a fost foarte constantă între diferite experimente – între 1 și 4 µg mg−1 proteină mitocondrială. Urografina-mitocondriile purificate din ficat de șobolan, rinichi de șobolan și inimă bovină – conțineau aproape 10 ori mai puțin ADN, între 0, 2 și 0, 6 µg ADN per mg proteină., Mitocondriul tipic de mamifere a fost calculat să conțină 3 × 10-17 G ADN. Presupunând că ADN-ul a fost dublu catenar, ar putea codifica nu mai mult de 1,2 MDa de lanțuri polipeptidice. Acest rezultat a fost considerat important, deoarece a exclus ferm posibilitatea ca mtDNA să codifice toate proteinele mitocondriale. Astăzi, acest calcul timpuriu de Haslbrunner și colab. ar putea fi contestată din mai multe motive, dar s-a apropiat remarcabil de realitate: cele 13 polipeptide codificate de mtDNA de mamifere au o masă totală de 0.,423 MDa, iar restul potențialului de codificare este în mare parte reprezentat de gene pentru ARN-uri ribozomale și de transfer, precum și de faptul că mitocondriile au de obicei mai mult de o copie a genomului ADN.
