discuție
pata Gram este cea mai utilizată procedură de colorare în bacteriologie. Se numește o pată diferențială, deoarece diferențiază între bacteriile Gram-pozitive și Gram-negative. Bacteriile care pata violet cu procedura de colorare Gram sunt denumite Gram-pozitive; cei care pata roz sunt declarat a fi Gram-negativ. Termenii pozitivi și negativi nu au nimic de-a face cu sarcina electrică, ci pur și simplu desemnează două grupuri morfologice distincte de bacterii., bacteriile Gram-pozitive și Gram-negative se colorează diferit din cauza diferențelor fundamentale în structura pereților celulari. Peretele celular bacterian servește pentru a da organismului dimensiunea și forma sa, precum și pentru a preveni Liza osmotică. Materialul din peretele celular bacterian care conferă rigiditate este peptidoglican. în micrografele electronice, peretele celular Gram-pozitiv apare ca un perete larg, dens, cu grosimea de 20-80 nm și format din numeroase straturi de peptidoglican interconectate (figurile 1a și 1b). Din punct de vedere chimic, 60 până la 90% din peretele celular Gram-pozitiv este peptidoglican., Întrețesute în peretele celular al acizilor Teichoici gram-pozitivi. Teichoic acizi, care se extind prin și dincolo de restul peretelui celular, sunt compuse din polimeri de glicerol, fosfați, și zahăr alcool ribitol. Unii au lipide atașate (acid lipoteichoic). Suprafața exterioară a peptidoglicanului este împânzită cu proteine care diferă de tulpina și speciile bacteriei.,peretele celular Gram-negativ, pe de altă parte, conține doar 2-3 straturi de peptidoglican și este înconjurat de o membrană exterioară compusă din fosfolipide, lipopolizaharide, lipoproteine și proteine (figurile 2A și 2b). Doar 10% – 20% din peretele celular Gram-negativ este peptidoglican. Fosfolipidele sunt localizate în principal în stratul interior al membranei exterioare, la fel ca lipoproteinele care leagă membrana exterioară de peptidoglican., Lipopolizaharidele, situate în stratul exterior al membranei exterioare, constau dintr-o porțiune lipidică numită lipidă a încorporată în membrană și o porțiune polizaharidică care se extinde spre exterior de pe suprafața bacteriană. Membrana exterioară conține, de asemenea, o serie de proteine care diferă de tulpina și speciile bacteriei.,
Pentru mai multe informații asupra germenilor Gram-negative și Gram-pozitive peretele celular, consultați următoarele Obiecte de Învățare în Curs de folosire:
- Celule Procariote Perete; Unitatea 1, Secțiunea IIB2
- bacterii Gram-Pozitive Peretele Celular; Unitatea 1, Secțiunea IIB2a
- Gram-Negative Peretele Celular; Unitatea 1, Secțiunea IIB2b
Gram colorare procedura implică patru etape de bază:
1. Bacteriile sunt mai întâi colorate cu colorantul de bază crystal violet. Atât bacteriile Gram-pozitive, cât și cele Gram-negative devin direct colorate și apar violet după acest pas.,
2. Bacteriile sunt apoi tratate cu soluția de iod Gram. Acest lucru permite ca pata să fie reținută mai bine prin formarea unui complex insolubil de cristal violet-iod. Ambele bacterii Gram-pozitive și Gram-negative rămân purpurii după această etapă.
3. Se adaugă apoi decoloratorul Gram, un amestec de alcool etilic și acetonă. Acesta este pasul diferențial. Bacteriile Gram-pozitive rețin complexul cristal violet-iod în timp ce Gram-negative sunt decolorate.
4. În cele din urmă, se aplică contra-stain safranin (de asemenea, un colorant de bază)., Deoarece bacteriile Gram-pozitive sunt deja colorate violet, ele nu sunt afectate de contra-stain. Bacteriile Gram-negative, care sunt acum incolore, devin direct colorate de safranin. Astfel, Gram-pozitive apar violet, iar Gram-negative apar roz.
© Daniel Cavanaugh, Marca Keen, autori, Licențiate pentru utilizare, AȘM MicrobeLibrary.,cu teoria actuală din spatele colorării Gram, se crede că în bacteriile Gram-pozitive, violetul de cristal și iodul se combină pentru a forma o moleculă mai mare care precipită în interiorul celulei. Amestecul alcool / acetonă determină apoi deshidratarea peptidoglicanului multistrat, reducând astfel spațiul dintre molecule și determinând peretele celular să prindă complexul cristal violet-iod din interiorul celulei., În cazul bacteriilor Gram-negative, amestecul alcool / acetonă, fiind un solvent lipidic, dizolvă membrana exterioară a peretelui celular și poate deteriora, de asemenea, membrana citoplasmatică la care este atașat peptidoglicanul. Cele câteva straturi de peptidoglican nu sunt capabile să rețină complexul cristal violet-iod și celula este decolorată. este important de menționat că Gram-pozitivitatea (capacitatea de a păstra complexul violet de cristal violet-iod) nu este un fenomen total sau nimic, ci o chestiune de grad., Există mai mulți factori care ar putea duce la o colorare Gram-pozitivă a organismului Gram-negativ:
1. Metoda și tehnicile utilizate. Supraîncălzirea în timpul fixării căldurii, decolorarea cu alcool și chiar spălarea prea mare cu apă între trepte pot duce la pierderea bacteriilor Gram-pozitive din complexul cristal violet-iod.
2. Vârsta culturii. Culturile mai vechi de 24 de ore își pot pierde capacitatea de a reține complexul cristal violet-iod.
3. Organismul în sine., Unele bacterii Gram-pozitive sunt mai capabile să rețină complexul cristal violet-iod decât altele. prin urmare, trebuie să se utilizeze tehnici foarte precise în colorarea Gram și să se interpreteze rezultatele cu discreție.
Trypticase Soy agar placa de culturi de Escherichia coli (un mic, Gram-negative bacillus) și Staphylococcus epidermidis (un Gram-pozitive coc cu un stafilococ aranjament).
procedura (a se face individual)
1., Escherichia coli
un. Căldură-fix un frotiu de Escherichia coli, după cum urmează:
1. Folosind flaconul cu picurător de apă deionizată găsit în suportul de colorare, așezați 1/2 dintr-o picătură de apă de dimensiuni normale pe o lamelă curată atingând picurătorul de lamelă (Figura 1). Altenately, utilizați bucla de inoculare sterilizate pentru a plasa o picătură de apă deionizată pe diapozitiv.
2., Folosind bucla sterilă de inoculare, îndepărtați aseptic o cantitate mică de cultură de pe suprafața agarului și atingeți – o ușor de 2-3 ori până la picătura de apă până când apa devine vizibil tulbure (Figura 2). Un frotiu bun cu cantitatea corectă de bacterii este esențial pentru colorarea Gram. prea multe bacterii de pe lamă ar putea duce la sub-decolorare; prea puține ar putea duce la supra-decolorare.
3. Incinerați bacteriile rămase pe bucla de inoculare., Dacă se adaugă prea multă cultură în apă, nu veți vedea bacterii individuale colorate și este posibil să nu aveți o pată Gram fiabilă.
4. După ce bucla de inoculare se răcește, întindeți suspensia peste aproximativ jumătate din diapozitiv pentru a forma o peliculă subțire. Un frotiu pregătit corect cu cantitatea potrivită de bacterii ar trebui să arate similar cu Fig. 3.
5. Lăsați această suspensie subțire să se usuce complet la aer (Figura 4). Frotiul trebuie să fie complet uscat înainte ca diapozitivul să fie fixat la căldură!
6., Pentru a încălzi bacteriile de pe lamelă, ridicați lamela uscată la aer cu forceps de acoperire și țineți partea inferioară a lamei opusă frotiului în apropierea deschiderii microincineratorului timp de 10 secunde (Figura 5), După cum a demonstrat instructorul dvs. Dacă diapozitivul nu este suficient de încălzit, toate bacteriile se vor spăla. Dacă este supraîncălzit, integritatea structurală a bacteriilor poate fi deteriorată.
b. Stain cu violet de cristal Hucker timp de un minut (Figura 6). Spălați ușor cu apă (Figura 7). Scuturați excesul de apă, dar nu uscați între trepte.
c., Se spală cu soluție de iod Gram timp de un minut (figura 8) și se spală ușor cu apă.
d. Decolorize prin ridicarea glisați și lasă Gram decolorizer rula în jos diapozitiv până la violet doar nu mai curge în partea de jos a slide (Figura 9).
- asigurați-vă că întregul frotiu este decolorat uniform și că nu sunteți sub-decolorant sau supra-decolorant.
- spălați imediat cu apă.
E. pata cu safranin timp de un minut (Figura 10)., Când spălați excesul de safranină, fiți foarte atenți să spălați ușor și scurt, deoarece este posibil să spălați o parte din sarfanina din bacterie.
f. ștergeți uscat (Figura 11) și observați folosind microscopie de imersie în ulei.
2. Staphylococcus epidermidis
un. Căldură-fix un frotiu de Staphylococcus epidermidis, după cum urmează:
1. Folosind flaconul cu picurător de apă deionizată găsit în suportul de colorare, așezați 1/2 dintr-o picătură de apă de dimensiuni normale pe o lamelă curată atingând picurătorul de lamelă (Figura 1)., Altenately, utilizați bucla de inoculare sterilizate pentru a plasa o picătură de apă deionizată pe diapozitiv.
2. Folosind bucla sterilă de inoculare, îndepărtați aseptic o cantitate mică de cultură de pe suprafața agarului și atingeți – o ușor de 2-3 ori până la picătura de apă până când apa devine vizibil tulbure (Figura 2).prea multe bacterii de pe lamă ar putea duce la sub-decolorare; prea puține ar putea duce la supra-decolorare.
3. Incinerați bacteriile rămase pe bucla de inoculare., Dacă se adaugă prea multă cultură în apă, nu veți vedea bacterii individuale colorate și este posibil să nu aveți o pată Gram fiabilă.
4. După răcirea buclei de inoculare, întindeți suspensia pe aproximativ jumătate din lamă pentru a forma o peliculă subțire (figura 3).
5. Lăsați această suspensie subțire să se usuce complet la aer (Figura 4). Frotiul trebuie să fie complet uscat înainte ca diapozitivul să fie fixat la căldură!
6., Pentru a încălzi bacteriile de pe lamelă, ridicați lamela uscată la aer cu forceps de acoperire și țineți partea inferioară a lamei opusă frotiului în apropierea deschiderii microincineratorului timp de 10 secunde (Figura 5), După cum a demonstrat instructorul dvs. Dacă diapozitivul nu este suficient de încălzit, toate bacteriile se vor spăla. Dacă este supraîncălzit, integritatea structurală a bacteriilor poate fi deteriorată.
b. Stain cu violet de cristal Hucker timp de un minut (Figura 6). Spălați ușor cu apă (Figura 7). Scuturați excesul de apă, dar nu uscați între trepte.
c., Se spală cu soluție de iod Gram timp de un minut (figura 8) și se spală ușor cu apă.
d. Decolorize prin ridicarea glisați și lasă Gram decolorizer rula în jos diapozitiv până la violet doar nu mai curge în partea de jos a slide (Figura 9).
- asigurați-vă că întregul frotiu este decolorat uniform și că nu sunteți sub-decolorant sau supra-decolorant.
- spălați imediat cu apă.
E. pata cu safranin timp de un minut (Figura 10)., Când spălați excesul de safranină, fiți foarte atenți să spălați ușor și scurt, deoarece este posibil să spălați o parte din sarfanina din bacterie.
f. ștergeți uscat și observați folosind microscopie de imersie în ulei.
3. Asigurați-vă că turnați cu atenție colorantul utilizat în tava dvs. de colorare în recipientul de colectare a coloranților, nu pe chiuvetă.
© Hussein Shoeb, autor. Licențiat pentru utilizare, MicrobeLibrary ASM.
B., Multe bacterii secretă o acoperire vâscoasă, vâscoasă, numită capsulă sau glycocalyx . Aceasta este de obicei compusă din polizaharidă, polipeptidă sau ambele. capacitatea de a produce o capsulă este o proprietate moștenită a organismului, dar capsula nu este o componentă celulară absolut esențială. Capsulele sunt adesea produse numai în condiții specifice de creștere. Chiar dacă nu sunt esențiale pentru viață, capsulele P ajută ferm bacteriile să supraviețuiască în natură., Capsulele ajută multe bacterii patogene și normale ale florei să reziste inițial fagocitozei de către celulele fagocitare ale gazdei. În sol și apă, capsulele ajută la prevenirea ingerării bacteriilor de protozoare. Capsulele ajută, de asemenea, multe bacterii să adere la suprafețe și astfel să reziste la spălare. De asemenea, permite multor bacterii să formeze biofilme. Un biofilm constă în straturi de populații bacteriene care aderă la celulele gazdă și încorporate într-o masă capsulară comună.,
Pentru mai multe informații privind bacteriene capsule, consultați următoarele Obiecte de Învățare în Curs de folosire:
- Glycocalyx (Capsula) și S-Layer; Unitatea 1, Secțiunea IIB4a
- Capacitatea De a Rezista Fagocitare Incident; Unitatea 3, Secțiunea B5b
ORGANISM
Lapte Degresat bulion de cultură de Enterobacter aerogenes. Laptele degresat furnizează substanțe nutritive esențiale pentru producția de capsule și oferă, de asemenea, un fundal ușor colorabil.
procedura (a se face individual)
1., Amestecați cultura bulionului de lapte degresat cu bucla dvs. și așezați 2-3 bucle de Enterobacter aerogenes pe o lamelă de microscop.
2. Folosind bucla de inoculare, întindeți proba pentru a acoperi aproximativ un centimetru din diapozitiv.
3. Lăsați-l să se usuce complet. Nu încălziți fix. Capsulele se lipesc bine de sticlă, iar căldura poate distruge capsula.
4. Stain cu violet de cristal timp de un minut.
5. Spălați excesul de colorant cu soluție de sulfat de cupru 20%.
6. Se agită excesul de soluție de sulfat de cupru și se usucă imediat.
7. Observați utilizarea microscopiei cu imersie în ulei., Organismul și laptele uscat pe diapozitiv vor ridica colorantul violet în timp ce capsula va rămâne incoloră.
8. Asigurați-vă că turnați cu atenție colorantul utilizat în tava dvs. de colorare în recipientul de colectare a coloranților, nu pe chiuvetă.
9. Observați pata de capsulă demonstrativă a Streptococcus lactis, o bacterie încapsulată care este flora normală în lapte.
A. pata Gram
faceți desene ale fiecărei bacterii pe preparatul dvs. de pete Gram.,
|
|
|
| Color = Gram reaction = Shape = |
Color = Gram reaction = Shape = Arrangement = |
B., Pata capsulei
faceți un desen al preparării petelor capsulei de Enterobacter aerogenes și pata capsulei demonstrative de Streptococcus pneumoniae.
Capsula pata de
Streptococcus lactis
