este nevoie de un efort real pentru a vă menține cunoștințele de bază despre biologia moleculară și celulară proaspete, pe lângă tot ce trebuie să faceți. Nu ar fi minunat dacă ar exista un loc unde puteți găsi articole ușor de citit care vă permit să vă periați pe aceste elemente de bază în doar câteva minute?
…sper că ai spus „da”, pentru că acesta este scopul meu „elementele de bază:” serie de articole, pe care le-am deja, și va continua să, aduce la tine periodic. Acest articol explică elementele de bază ale ligării ADN-ului.,
amicul dvs. de ligare a ADN-ului: ligaza ADN
ligaza ADN (EC 6.5.1.1) este enzima care stă la baza reacției de ligare a ADN-ului. Se alătură covalent coloanei vertebrale fosfatice a ADN-ului cu capete coezive contondente sau compatibile (vezi Figura 1) și rolul său natural este în repararea rupturilor duble ale moleculelor de ADN. În biologia moleculară este frecvent utilizat pentru inserarea fragmentelor de ADN generate de enzime de restricție în coloana vertebrală vectorială. Ligazele comerciale sunt furnizate cu un tampon de reacție care conține ATP și Mg2+, care sunt ambele esențiale pentru activitatea ligazei., Deoarece ATP poate fi deteriorat de ciclurile repetate de îngheț-dezgheț, este recomandabil să faceți alicote ale tamponului (consultați articolul meu „5 sfaturi de ligare a ADN-ului”).
Figura 1. Capete coezive și contondente, gata pentru ligarea ADN-ului!
cele două etape ale reacției de ligare a ADN-ului
reacția de ligare a ADN-ului în sine are două etape de bază. În primul rând, capetele ADN trebuie să se ciocnească din întâmplare și să rămână împreună suficient de mult pentru ca ligaza să li se alăture. Aceasta este partea cea mai ineficientă a reacției, dar este mai ușoară la temperaturi scăzute. De ce?, Ei bine, după cum probabil știți, toate moleculele se mișcă mai repede la temperaturi mai ridicate, așa că vă puteți imagina că va fi mai ușor pentru două capete de ADN să se ciocnească și să rămână împreună dacă plutesc ușor prin soluție la temperatură scăzută, mai degrabă decât să bâjbâie așa cum ar fi la temperaturi mai ridicate. Pentru capetele coezive, există un motiv suplimentar; temperaturile mai scăzute stabilizează legătura de hidrogen dintre nucleotidele complementare, ceea ce ajută cu adevărat la menținerea lucrurilor în loc.
Figura 2., Reacția enzimatică a ligării ADN
a doua etapă este reacția enzimatică, care este prezentată schematic în Figura 2.. ADN ligaza catalizează îmbinarea 3′-OH la 5 ‘ – fosfat printr-un mecanism în două etape. În primul rând, nucleotida AMP, care este atașată la un reziduu de lizină în locul activ al enzimei, este transferată la 5’-fosfat. Apoi legătura AMP-fosfat este atacată de 3 ‘ – OH, formând legătura covalentă și eliberând amperi. Pentru a permite enzimei să efectueze alte reacții, AMP în situsul activ al enzimei trebuie să fie reumplut cu ATP.,
Iată ce ne-efectuarea ADN-Ligatura la temperaturi scăzute poate ajuta
ADN-ul ligase enzimă are activitatea optimă la 25°C, astfel încât ligatura reacția este efectuată la o temperatură care este un trade-off între temperaturile optime pentru aducerea ADN-ul se termină împreună (1°C) și reacția enzimatică (25°C). În mod normal, 1 oră la 16°C este bine, dar deoarece aducerea ADN-ului se termină împreună este partea cea mai puțin eficientă a reacției favorizând acest lucru prin scăderea temperaturii la 4°C poate da și mai multă eficiență. Cu toate acestea, enzima va funcționa foarte lent la această temperatură atât de lungă (de ex., peste noapte) este necesar timpul de incubație.
publicat inițial la 31 octombrie 2007; actualizat și republicat la 5 decembrie 2014.
v-a ajutat acest lucru? Apoi, vă rugăm să partajați cu rețeaua.
