Good Mood

Rezultate și Discuții

Arabidopsis adnc biblioteca a fost proiectat prin utilizarea 35S-etichetate CaM-obligatoriu screening-ul abordare descrise (24). Una dintre clonele pozitive a arătat o secvență nucleotidică identică cu AtCat3 în baza de date (accesia GenBank nr. U43147). Pentru a dovedi că AtCat3 codificat de o CaM-proteine de legare, complet regiunea de codificare a AtCat3 fost subclonat în pET14b expresia vectorială. Atcat3 recombinant a fost indus de izopropil β-d-tiogalactozidă (IPTG) (Fig., 1A) și a fost purificat prin cromatografie cu afinitate CaM până la omogenitate apropiată. Extractul bacterian Total a fost utilizat pentru testul de legare a camei și sa demonstrat că CaM-ul marcat cu 35S se leagă de proteina AtCat3 în prezența Ca2+ (Fig. 1a). După adăugarea EGTA, nu s-a observat nicio legare a camei. Mai mult, cam-ul marcat cu 35S nu s-a legat de AtCat3 atunci când CaCl2 a fost înlocuit cu alți cationi bivalenți, cum ar fi MgCl2 sau MnCl2 (Fig. 1A), sugerând că legarea CaM la AtCat3 este dependentă de Ca2+.

pentru a identifica zona de legare a camei în AtCat3, doi mutanți de ștergere C-terminal au fost utilizați pentru testele de legare a 35S-CaM. În prezența 0.,2 mM Ca2+, CaM se leagă de tipul sălbatic și mutantul 1-451, în timp ce CaM nu se leagă de mutantul 1-414 (Fig. 1B), sugerând că regiunea de legare a camei pentru AtCat3 este limitată la aminoacizii 415-451. Pentru a confirma în continuare legarea CaM la AtCat3, o peptidă sintetică corespunzătoare aminoacizilor 415-451 din AtCat3 a fost incubată cu CaM. Formarea complexului peptidic-CaM A fost evaluată prin pagina nedenaturantă. Peptida 36-mer este capabilă să formeze un complex stabil cu CaM în prezența Ca2+ (Fig. 1C). În absența peptidei, a fost observată o singură bandă camă., Pe măsură ce concentrația peptidei a crescut, a apărut o altă bandă cu mobilitate scăzută, reprezentând complexul peptid-CaM. Când raportul molar dintre peptidă și CaM A fost 1:1, a fost detectată numai banda complexă peptidă-cam, indicând faptul că există un singur situs de legare a camei în peptidă. Nu s-a format niciun complex peptidic-CaM în prezența EGTA (Fig. 1C). Aceste rezultate indică faptul că CaM se leagă în mod specific de AtCat3 într-o manieră dependentă de calciu.catalaza există în aproape toate organismele aerobe. La animale, există o singură izoformă catalază codificată de o singură genă., În schimb, catalaza din plante este prezentă ca izoforme multiple codificate de o familie de gene mici (6, 26). Cel puțin acest lucru este valabil în monocoturile precum porumbul și dicoturile, cum ar fi tutunul, Arabidopsisul și dovleacul, în care catalaza este bine caracterizată. Interesant este că fiecare dintre ele are trei izoforme codificate de trei gene. Pentru a determina dacă toate catalases au CaM obligatoriu regiuni, secvențele de aminoacizi de 37 catalases de bacterii, animale și plante au fost comparate cu ajutorul pileup program în GCG10 pachet., Comparația secvenței de aminoacizi a relevat o omologie foarte mare în n-terminal 384 aa (aproximativ 60% similitudine și 50% identitate). Cu toate acestea, în C-terminal 108 aa, unde CaM-regiune de legare este situat, era foarte puțină asemănare între AtCat3 și alte nonplant catalases (aproximativ 21% omologie și 14% identitate). Cu toate acestea, toate plante catalases arătat un grad înalt de omologie în această parte (aproximativ 78% omologie și 70% identitate), în special în regiunea corespunzătoare CaM-obligatoriu zonă în AtCat3. Fig. 2 arată Compararea secvenței C-terminal 108-aa A 13 catalaze reprezentative., Deși secvențele de aminoacizi în caracterizat CaM-proteine de legare nu sunt conservate în CaM-obligatoriu regiune, cele mai multe dintre ele au o secundară caracteristică structurală de bază amfifile α-helix (27), cum ar fi auxin-reglementate de proteine ZmSAUR1 (24) și planta himeric Ca2+/CaM proteine kinaza (28). Rețineți că există adesea aminoacizi încărcați negativ în regiunile de legare a camelor, dar încărcarea netă este pozitivă (16). Bazat pe elicoidale roata de proiecție folosind GCG program, s-a stabilit că aminoacizii 438-451 în AtCat3 sunt capabile să formeze o bază amfifile α-helix., Este clar că o parte a roții elicoidale este hidrofobă, iar cealaltă parte este hidrofilă cu sarcini nete pozitive. Analiza secvențele de aminoacizi corespunzătoare CaM-regiune de legare de AtCat3 prezis existența de o bază amfifile α-helix în unele dintre alte plante catalases. Interesant, printre trei izoforme catalazice din porumb, tutun, Arabidopsis și dovleac, există cel puțin o izoformă cu structura α-elicoidală amfifilă la fiecare specie, de exemplu.,, tobacco1 (aminoacizi 431-444), maize3 (aminoacizi 442-455), și pumpkin1 (aminoacizi 438-451), precum și Arabidopsis AtCat1 (aminoacizi 438-451). Dacă este adevărat pentru toate speciile de plante nu este clar din cauza secvențelor catalazice limitate pentru alte specii de plante din GenBank. Bazat pe structura de cristal de date bacteriene și de mamifere catalases, α-helixuri sunt structuri tipice în C-terminal parte din aceste catalases (29), dar nu de bază amfifile α-structură elicoidală există în această porțiune potrivit elicoidale roata de proiecție., pentru a testa dacă CaM se leagă de catalaza purificată din planta, catalaza de tutun a fost purificată din frunzele pe bază de Durner și Klessig (10). O coloană Cam-Sepharose a fost utilizată ca ultima etapă în procesul de purificare. Rezumatul etapelor de purificare a catalazei folosind 1000 g de frunze de tutun este prezentat în tabelul 1. Catalaza de tutun a fost purificată până aproape de omogenitate, după cum se consideră prin SDS/PAGE și colorarea cu argint (Fig. 3, banda 1). Identitatea catalazei a fost confirmată de western blotting cu un mAb împotriva catalazei de tutun (Fig. 3, banda 3)., Legarea CaM la catalaza de tutun purificată a fost demonstrată prin următoarele abordări. (i) o coloană Cam-Sepharose a fost utilizată pentru purificarea catalazei de tutun. Rata de recuperare pentru această etapă a fost de 81% (Tabelul 1), sugerând că cea mai mare parte a catalazei din frunzele de tutun este o proteină care leagă CaM. (ii) camul marcat cu 35S a fost utilizat pentru a testa legarea la catalaza purificată în prezența CaCl2 de 0,2 mM (Fig. 3, banda 5). Atcat3 Recombinant a fost utilizat ca martor (Fig. 3, benzile 2, 4 și 6). Adăugarea de 0.,4 mm EGTA abolit cam obligatorii, sugerând că CAM se leagă la catalaza de plante într-un mod dependent de Ca2+. Testele de legare a CaM au fost, de asemenea, efectuate pentru a determina dacă se leagă de catalaza fungică, bovină sau umană. Rezultatele au arătat că niciunul dintre aceste nonplant catalases arătat CaM obligatoriu (datele nu sunt prezentate), care este în acord cu secvența de aminoacizi comparații (Fig. 2).,

CaM-site-ul de legare sau strâns juxtapuse în alte regiuni caracterizate CaM-proteine de legare de multe ori funcționează ca autoinhibitory sau pseudosubstrate domenii. Această regiune menține proteinele țintă într-o stare inactivă în absența semnalului Ca2+, cum ar fi în kinaza proteică dependentă de Ca2+/cam (30) și decarboxilaza glutamat (31). Pentru a studia semnificația legării CaM la catalazele vegetale, activitățile catalitice ale atcat3 recombinant și catalaza de tutun purificat au fost măsurate în prezența și absența CaCl2 și CaM., Experimente similare, de asemenea, au fost efectuate prin utilizarea altor catalaze nonplant. Atcat3 recombinant exprimat în E. coli nu a prezentat activitate. Rezultate similare au fost obținute într-un alt laborator (Zhixiang Chen, comunicare personală). Acest lucru poate fi rezultat din eșecul de a forma structura corectă pentru catalaza recombinantă, deoarece catalaza activă este un tetramer format din patru subunități identice sau similare (6, 10, 26). În schimb, catalaza de tutun purificată a arătat o schimbare semnificativă a activității dependente de Ca2+/CaM în timpul etapelor de purificare (Tabelul 1)., Efectele stimulatoare ale Ca2+/CaM sunt de aproximativ 2,2 ori în fiecare etapă, cu excepția probei care a fost obținută după cromatografia Cam-Sefaroză. Acesta a arătat o stimulare mai mare a activității catalazei (de 2,5 ori) posibil datorită eliminării fracției de catalază care nu leagă Ca2+/CaM (Tabelul 1). Fracțiunea de catalază care nu leagă Ca2+ / CaM A avut o activitate specifică de 59,6 unități (activitate bazală). Cu toate acestea, Ca2+/CaM nu a stimulat activitatea acestei fracții de catalază (datele nu sunt prezentate)., Aceste rezultate indică faptul că Ca2+/CaM este capabil să activeze catalaza de tutun în fracțiunea obținută după cromatografia Cam-Sepharose, care corespunde rezultatelor legării CaM. Pentru a compara efectele Ca2+ / CaM asupra activității catalazelor din diferite surse, a fost utilizată activitatea relativă, deoarece există o diferență semnificativă în activitatea specifică a catalazelor din diferite specii. De exemplu, catalaza A. niger are activitatea specifică de 5,7 unități; catalaza hepatică bovină, 51,9 unități; eritrocite umane, 39,5 unități; catalaza de tutun, 63.,1 unități (în absența Ca2+/CaM). Fig. 4a arată că CaCl2 singur sau CaM singur nu a avut niciun efect stimulator asupra activității catalazei de tutun (aproximativ 40% din activitatea maximă). Nu s-a observat nicio diferență în activitatea catalitică la catalazele fungice, bovine sau umane în prezența sau absența Ca2+, CaM și Ca2+/CaM (Fig. 4a). Prin înlocuirea CaCl2 cu MgCl2, nu a existat nicio modificare semnificativă a activității catalazei de tutun în prezența sau absența CaM (datele nu sunt prezentate)., Pentru a documenta în continuare efectul Ca2+/CaM asupra activității catalazei vegetale, la fiecare amestec de reacție s-au adăugat 10 µM de peptidă corespunzătoare Regiunii de legare a camei AtCat3 (415-451). Catalazele Nonplant nu au fost afectate de adăugarea peptidei. Cu toate acestea, efectul stimulator al Ca2+ / CaM asupra activității catalazei de tutun a fost eliminat prin adăugarea peptidei (Fig. 4a). În plus, efectul inhibitor al peptidei asupra activității catalazei de tutun depinde de concentrația peptidei (Fig. 4b)., Activitatea catalazei a fost inhibată cu aproximativ 58%, ceea ce este aproape de activitatea bazală a catalazei. Cu toate acestea, peptida nu a avut niciun efect asupra activității catalazei bovine la toate concentrațiile testate (Fig. 4a). Aceste rezultate sugerează că Ca2+ / CaM are un efect stimulator asupra catalazei vegetale purificate, dar nu are niciun efect asupra catalazelor nonplante. Figura 4

calciu / CaM reglează activitatea catalitică a catalazei vegetale. Activitatea catalazei a fost măsurată prin monitorizarea descompunerii H2O2 la 240 nm înainte și după adăugarea catalazei în prezența și absența Ca2+ și/sau CaM., Activitatea a fost exprimată ca procent din activitatea maximă pentru fiecare catalază. Datele sunt media ± SE din patru experimente separate. (A) cam activează catalaza de tutun în prezența calciului. Peptida corespunzătoare regiunii de legare a camei în AtCat3 (aminoacizii 415-451) inhibă activitatea catalazei de tutun. (B) cinetica inhibării activității catalazei de tutun de către peptidă (aminoacizii 415-451). ● , catalază hepatică bovină;○, catalază de tutun.,se știe că catalaza este o enzimă peroxizomală predominantă, dar există și în mitocondrii și citoplasmă (32). De exemplu, porumbul Cat3, care ar putea fi o catalază de legare a camei bazată pe compararea secvenței de aminoacizi, este o proteină mitocondrială (33). Rezultatele noastre (Fig. 1-4) demonstrați că CaM se leagă de catalaza plantelor și își reglează activitatea. Pentru a demonstra prezența acestei activități de reglementare in vivo, am studiat dacă CaM coexistă cu catalaza în peroxizomii plantelor., Organelele din extractele de cotiledon de dovleac etiolate au fost separate prin centrifugarea densității de zaharoză. Pentru a elimina contaminarea citosolic proteine care ar putea fi prezente în soluție, sau pur și simplu asociat cu peroxisomal membrana, izolat peroxizomi au fost tratați cu proteinaza K. În acest fel, peroxisomal proteine protejat de protează de peroxisomal membrana nu au fost digerate (34, 35). Identitatea fracțiilor peroxizomale a fost demonstrată prin măsurarea activității catalazei (35)., CaM este foarte conservat peste regate (13-16), de aceea am făcut analiza Occidentală cu un anticorp CaM anti-uman. Ca martor, s-a utilizat cartoful recombinant cam PCM6 (Fig. 5, banda 3). Interesant este că o bandă cu o dimensiune similară cu PCM6 a fost prezentă în fracțiunile peroxisomale, dar intensitatea a fost considerabil mai mică comparativ cu cama citosolică (Fig. 5). Aceste rezultate indică faptul că CaM și catalaza sunt colocalizate în peroxizomi. CaM este o proteină acidă mică care este exprimată în principal în citoplasmă., Cu toate acestea, în plante, CaM sa dovedit a fi prezent în mai multe organele, cum ar fi nucleul și cloroplastele (36, 37) și matricea extracelulară (38). De asemenea, proteinele reglate de CaM există în matricea extracelulară, nucleul și cloroplastele (38-40). Modul în care Cam traversează membrana nu este clar. Studii recente indică faptul că modificările posttranslaționale joacă un rol în translocarea unor izoforme CaM. De exemplu, un petunia CaM-cum ar fi proteine, CaM53, este asociat cu membrana plasmatică, atunci când proteina este prenylated. Dacă prenilarea este inhibată, CaM53 se găsește predominant în nucleu (41)., figura 5

existența CaM în peroxizomi. Douăzeci de micrograme de proteine totale din peroxizom și citozol au fost separate în 15% SDS / PAGE și supuse analizei occidentale. CaM a fost detectat de un anticorp anti-bovin CaM. Două micrograme de cartof recombinant cam PCM6 a fost utilizat ca martor. Banda 1, fracția peroxizomului; banda 2, fracția citozolului; banda 3, PCM6.din cunoștințele noastre, nu există niciun raport care să discute concentrația de calciu în peroxizomi., Pe baza unui model modificat recent al biogenezei peroxizomului, peroxizomul provine din reticulul endoplasmatic (ER) prin intermediul veziculelor preperoxisomale (42). Se știe că ER este unul dintre bazinele intracelulare de calciu. Astfel, concentrația de calciu în peroxizomi ar putea fi la fel de mare ca în ER. Măsurarea concentrației de calciu peroxizomal și monitorizarea oricărei legături între modificarea concentrației de calciu în citoplasmă și peroxizom ar trebui să ajute la înțelegerea modului în care catalaza peroxizomală este reglată de Ca2+/CaM., De exemplu, concentrația de calciu liber ar putea fi măsurată în plantele transgenice cu aequorina reconstituită cu un semnal de direcționare a peroxizomului. Aequorin este o proteină luminescentă sensibilă la calciu, a cărei luminiscență raportează direct modificarea calciului (43). Deoarece peroxizomul este o organelă majoră care elimină ROS toxic, în principal H2O2, este rezonabil să se speculeze că activitatea catalazei peroxisomale rămâne ridicată tot timpul pentru a degrada H2O2 in situ într-un ritm rapid. Cu toate acestea, fluctuațiile calciului citosolic ar putea avea un efect major asupra activității catalazei citosolice., Este important să subliniem că nu toate catalazele sunt proteine care leagă CaM. Prin urmare, sunt necesare investigații suplimentare pentru a aborda semnificația Ca2+/CaM în controlul activității catalazei în diferite organele.tensiunile biotice și abiotice declanșează un aflux de Ca2+, iar creșterea Ca2 + citosolică stimulează producerea de H2O2, care difuzează în celulele înconjurătoare ca mesager și induce răspunsul fiziologic (19, 20). Rezultatele noastre sugerează că creșterea Ca2 + citosolic poate reduce nivelurile de H2O2 prin stimularea mediată de Ca2 + /CaM a activității catalazei (Fig. 4)., Propunem ca creșterea Ca2 + citosolic să aibă dublu rol în reglarea homeostaziei H2O2 (Fig. 6): (i) regulamentul pozitiv generează H2O2 direct, prin activarea NADPH-oxidazei, care are afinitate pentru ionii de Ca2+ (22) și indirect producerea de mai multe NADPH prin intermediul Ca2+/CaM-reglementate NAD kinazei (23); și (ii) negativ regulamentul reduce H2O2 prin stimularea activității catalazei prin Ca2+/CaM modulare (Fig. 4)., Modificările induse de semnal în tranzitorii Ca2+ pot diferi în ceea ce privește frecvența, durata, amplitudinea și localizarea spațială a oscilațiilor și modul de propagare spațială, ceea ce duce la efecte diferențiale asupra proteinelor țintă de calciu (12, 44). figura 6 modelul care prezintă modificările declanșate de Ca2+care conduc la reglarea pozitivă și negativă a nivelului de H2O2 în plante. Pentru reglarea pozitivă, semnalele extracelulare declanșează un aflux de Ca2+, ceea ce crește generarea de H2O2., Acest lucru poate apărea prin activarea NADPH oxidazei, care are afinitate pentru Ca2+, și creșterea producției de NADPH prin intermediul nad kinazei reglate cu came. Pentru reglarea negativă, Ca2 + se leagă de CaM, iar complexul Ca2+/CaM stimulează activitatea catalitică a catalazei, ducând la degradarea rapidă a H2O2. Creșterea H2O2 poate stimula influxul de Ca2+ prin activarea canalului de calciu.