Good Mood

Tulokset

Käsittelemättömiä Näytteitä. Huomaamme erityisesti, että jopa kahlitsemattomissa näytteissä veden ja öljypisaroiden erot (kuva. 1 B ja C ) tai solun eri aineosien välillä (Kuva. 1D) luoda riittävä kontrasti erottaa ne. Soluissa Higher-Z-materiaalit, kuten suolat, fosfori ja rauta, jotka voivat olla keskittyneet eri alueille, pyrkivät parantamaan kontrastia. Kuva., 1D: ssä on hoitamaton kiinanhamsterin munasarjasolu (cho) normaalissa viljelyaineessa huoneenlämmössä. Soluhaarukka ja sen sisärakenne ovat selvästi näkyvissä, samoin sytoplasmassa olevat tummat, pallomaiset hiukkaset. Näiden hiukkasten tunnistamista lipidipisaroiksi käsitellään jäljempänä.

Raskasmetallivärjäys. Rajat resoluutio ja kontrasti, kun tarkkailemalla low-Z materiaalit viittaavat siihen, että merkittäviä etuja voidaan saavuttaa värjäämällä solut, joilla on korkea-Z markkereita, kuten electron-tiheä tahroja tai nanohiukkasten kultaa tarrat., Todellakin, voimme havaita kultaa helmiä vettä alas halkaisijaltaan 10 nm käyttämällä ultrathin kalvot (tiedot eivät ole näkyvissä).

Ero värjäys soluelimiin solujen sisällä käyttäen electrondense materiaalit on standardi EM: tekniikka, vaikka ei yleensä hakenut SEM. Kuva. 2 osoittaa runsaasti erilaisia rakenteita sisällä viljeltyjä soluja, jotka kasvatettiin suoraan väliseinän kalvo ja sitten kiinteä ja värjätään uranyyliasetaatti (8). Solunsisäiset organellit näkyvät selvästi, myös mitokondrioiden sisäiset yksityiskohdat (kuva. 2C), aktiinin stressikuidut (Kuva., 2D ), ja monimutkaisia putkimaisia ja sytoskeletaalisia rakenteita(Kuva. 2 A ja B ). Korkeampi palkki energiaa Kuvio. 2C luotaimet sisäinen rakenne, kun taas pienempi energia (Kuva. 2D), kalvon lähellä oleva pinta visualisoidaan. Kolmiulotteisen tiedon saamiseen voidaan siis käyttää erilaisia energioita.

Nanohiukkasten Kultaa Markkereita. Havaitsemisen suuri erottelukyky ja spesifisyys voidaan saavuttaa vasta-aineiden tai muiden ligandien sitoutumisella., Kuten muillakin EM-menetelmillä, merkinnät tehdään kätevimmin kultananohiukkasia käyttämällä. Toisin siirto EM (TEM), joka näytteistä vain hyvin ohut ja usein mielivaltainen kohdat, märkä SEM mahdollistaa nopean vaihtamisen välillä paikallisen ja globaalin näkymän merkinnät koko solun. Kuva. 3 A ja B osoittavat, miten 40-nm nanohiukkasten kulta-leimatut vasta-antiepidermal kasvutekijän reseptorin vasta-aineita käytettiin merkintöjä epidermaalinen kasvutekijä reseptoreihin ehjä A431 syöpäsoluja., Korjaus on usein hyödyllinen ja kätevä jopa märkä SEM ja voi helpottaa merkintöjä sekä siirtää mikroskoopin. Tässä esitetyt solut värjätään myös uranyyliasetaatilla, joka mahdollistaa merkittyjen reseptoreiden kohdistamisen solujen yleiseen rakenteeseen. Nanohiukkasten suuri kontrasti ja yhtenäinen koko mahdollistavat yksiselitteisen tunnistamisen ja lokalisoinnin. Tietäen tarkka lokalisointi yhden reseptorin molekyylejä avaa mahdollisuuden mitata tapahtumat, kuten epidermaalisen kasvutekijän aiheuttama reseptorin dimerization., Solujen värjäystä ei tarvita merkintöihin, ja olemme sisällyttäneet kuvaan kahlitsemattomia, merkittyjä soluja(Kuva. 7, joka julkaistaan PNAS: n verkkosivujen tukena). Kuvassa näkyy myös kuva, joka osoittaa, että solun sisäisten osien merkitseminen on mahdollista (Kuva. 8, joka julkaistaan PNAS-verkkosivujen tukena), tässä tapauksessa mitokondrioiden merkitseminen kultahelmillä. Aktiinifilamenttien merkitseminen solujen sisälle on myös saavutettu käyttämällä subnanometrin kultahiukkasia, minkä jälkeen hopeanhohto (tietoja ei ole esitetty).

esimerkki kulta merkintöjä bakteerit on esitetty Kuviossa. 3 C. Täällä, oletetun gastriini-reseptorin Helicobacter pylori (9) havaitaan itämisaika komplekseja biotinylated gastriini ja streptavidin-pinnoitettu 20-nm platinasta. Annetaan biotinylated gastriini ennen streptavidin-päällystetty kultaa tuottanut lähes mitään kiinnitys nanohiukkasten bakteeria. Tämä tulos oli saatu itsenäisesti välinen aika kaksi askelta, mikä viittaa siihen, että käyttöönotto gastriini osaksi H. pylori on lähes välitöntä., Se, että kompleksoidun gastriini ei pääse soluihin viittaa mahdollisuuteen määritellä rajat koon hiukkasia, jotka voivat olla sisäistetty bakteerit.

kuvantamistekniikoiden Vertailu (Trypanosoma brucei). On hyödyllistä verrata tätä tekniikkaa olemassa oleviin kuvantamistekniikoihin yhden mallin järjestelmällä. Tällainen tutkimus on esitetty yksityiskohtaisesti Kuvassa. 4, käyttäen loinen T. brucei procyclic muodossa, joka etenee puolivälissä tsetse lentää. Kolmessa ensimmäisessä kuvassa on olemassa olevat kuvantamistavat: optinen fluoresenssimikroskopia (Kuva., 4A ), differentiaalihäiriökontrastimikroskopia (Kuva. 4B), ja TEM (Kuva. 4 C). Olemassa olevien tekniikoiden vahvuus on ilmeinen: paikallinen merkintä fluoresenssissa ja yksityiskohtaiset kohdat TEM: ssä. Käsittelemätön optinen (Kuva. 4B ) ja wet-SEM (Kuva. 4D) kuvat rajaavat solun rajoja, mutta ovat sen vastakohtana matalia ja niissä ei ole yksityiskohtia. Molemmat korostavat ydin, mutta muut soluelimiin, jotka näkyvät ero häiriöitä sijaan kuva eivät ole selvästi tunnistettavissa, kun taas märkä-SEM kuva tuo rasva pisarat etu. Osmiumtetroksidivärjäys (Kuva., 4E) ei ole yhtä hyödyllinen tässä järjestelmässä, korostaen enimmäkseen lipidipisaroita ja joitakin tunnistamattomia sisäelimiä. Vahvin kuvantaminen näkyy Figissä. 4F, johon käytettiin uranyyliasetaattivärjäystä. Etu ehjä imaging koko solu voi olla nähnyt (yhdessä sen hieno sisäisiä rakenteita, jotka voidaan havaita yksityiskohtaisesti) on ilmeistä, erityisesti verrattuna TEM imaging (Fig. 4 C). Lopuksi, märkä-SEM kuvantaminen koko-cell-specific-merkintä vasta-aineita vastaan suuria glycosylphosphatidylinositol-ankkuroitu pinta takki proteiinia EP procyclin (10) on esitetty kuvassa., 4 G ja H . Mielenkiintoista, EP procyclin on tunnettu kattamaan koko solun tasaisesti, mutta havaittu signaali on ryhmitelty. Me yhdistän tämän suuntauksen taustalla rasva lautat klusterin vaikutuksen alaisena vasta-aineita, prosessi, joka korjaus formaldehydiin ei voi estää. Kultaa markkereita myös valaista kolmiulotteinen rakenne solun tavalla, joka muistuttaa siitä, mitä standardi voi SEM-kuva (erinomainen, edustaja SEM-kuva T. brucei löytyy osoitteesta http://tryps.rockefeller.edu/crosslab_intro.html).

Ilmeisesti, TEM on parempi resoluutio, yleensä, kuin märkä SEM, mutta kuvat esitetään esimerkki T. brucei vertailun ovat ”tyypillisiä” kuvia saanut samassa laboratoriossa., Koska märkä SEM on erilainen sen hyödyllisyys kuin TEM ja optinen mikroskopia, T. brucei se voidaan nähdä tärkeänä täydentävät valmiudet, ja voidaan olettaa, että koko kuva olisi antanut yhdistelmä optinen, TEM, ja märkä-SEM-tekniikkaa.

kudososat. Märkä SEM voidaan käyttää paksu näytteitä, kuten kudos fragmentteja, yksinkertaisesti asennus näyte vastaan-kalvo. Vähäinen näytteenotto syvyys BSEs avulla kuvantaminen ”virtuaalinen osassa,” ulottuu pintaan tulee määritellä syvyys enintään muutaman mikrometriä ilman tarvetta ohut leikkaus.,

kuva. 5 A ja B näyttää käsittelemättömien kudosten suoran visualisoinnin hiirestä. Kuva. 5A on pieni suurennos sydänkudoksesta. Lihassolujen järjestäytyminen on ilmeistä. Zoomaus yhteen soluun (Kuva. 5B ) antaa elävä näkymä tumaa ja solunsisäisiä organelleja, mahdollisesti mitokondrioita, ja niiden hajonta solussa. Kuten yllä varten viljellyt solut, värjäys kudosten on eduksi, mutta ei välttämätöntä, ja voi parantaa visualisointi monia ominaisuuksia. Kuva. 5 C ja D osoittavat rotan munuaiskuoren alueen., Värjäytyminen (kaliumferrisyanidi) korostaa munuaisten tubulusten epiteelin kokonaisorganisaatiota ja solukontakteja. Tarkka säätö värjäys ja kuvantamisen ehtoja voi paljastaa erilaisia ja toisiaan täydentäviä tietoja, kuten kudos arkkitehtuuri; esim., kudosten värjätään uraaninitraatti asetaatti saadaan selkeä kuva soluväliaineen (tiedot eivät ole näkyvissä).

Samanaikaisesti Fotoni Kokoelma (CL). BSE: n toteamista märällä SEM: llä voidaan täydentää fotonien samanaikaisella keräämisellä., Pyyhkäisyelektronisuihku innostaa näytteessä olevia molekyylejä, jotka sitten voivat säteillä valoa ominaisilla aallonpituuksilla (CL). Valon intensiteetti sitten käytetään saada kuvan jakelu säkenöivä molekyylejä, joko endogeeninen solun tai tarroja, jotka voidaan ottaa käyttöön extraneously. Tämä kuva on saatu samanaikaisesti imaging jonka BSE-resoluutio rajoittaa electron–aineen vuorovaikutusta ja ei valon diffraktio (6). Meidän liitetään kevyt ohjata nesteen alla näyte, joka ohjaa valon valoa photomultiplier., Tämä setup saavutetaan hyvä kytkentä ja tehokas kokoelma fotonit innoissaan electron beam vaarantamatta tehokkuutta samanaikaisesti BSE-taudin havaitsemiseksi.

kuva. 6 näyttää käsittelemättömiä CHO-soluja, joita BSE ja fotonit visualisoivat samanaikaisesti. Kuvassa. 6A , solujen rajat ovat selkeästi esitetty electron-kuvaustilassa, ja ydin (yhdessä sen nucleoli) on merkittävä, koska ovat tummat ≈1-µm paikkoja ympäri ydin. Nämä esiintyvät kaikkien tutkimiemme eukaryoottisten solujen sytoplasmassa, ja vaikka niiden määrä vaihtelee, ne yleensä hajoavat tuman ympärille., Kuvassa näkyvässä cl-kuvassa. 6B , solun ääriviivat ja tuma on selkeästi määritelty, ohjeellinen jakautuminen säkenöivä molekyylejä (samanlainen autofluorescence) solussa. Tässä tilassa samoille täplille on ominaista suuri fotonipäästö. Yhdistelmä korkea cathodoluminescent signaalin ja korkea hiilipitoisuus on tyypillinen rasva pisaroita (11), jotka osallistuvat energian varastointi solu (12)., Riippumaton testi 200 µM öljyhapon lisäämisestä aiheutti näiden pisaroiden voimakkaan leviämisen solussa (tietoja ei ole esitetty), mikä vastaa käsitystä, että havaitut kohdat ovat lipidipisaroita.

Märkä SEM on etulyöntiasema standardi SEM-tekniikoita säilyttäminen lipidien, erityisesti suuria aggregaatteja, kuten rasva pisaroita. Kuivaustarpeen poistaminen säästää lipidejä orgaanisista liuottimista, jotka voivat liuottaa niitä. Vaikka osmium hoito tulee säilyttää joitakin rasva bilayers, suurempia aggregaatteja osmium nopeasti reagoi luoda ulkoinen kuori, joka ei anna osmium, jättäen aggregaattien alttiita myöhemmin orgaanisia liuottimia hoito., Kryogeeniset valmisteet, taipumus pilkkominen prosessi crack pitkin rasva–vesi rajoja on myös vaara suuri rasva-rakenteita.

merkkiaineiden korkean resoluution kuvantaminen on CL-detektiomuodon erittäin toivottava ominaisuus, joka edellyttää tiettyjen molekyylien merkintöjen kehittämistä soluissa. Kuvassa. 9, joka on julkaistu tukevaa tietoa PNAS web-sivuston, meidän on osoitettava, että standardi loisteputki helmiä 0.2 µm halkaisijaltaan säteilevät fotonit voimakkaasti alle electron-palkki, ja se voidaan kuvata resoluutio ≈100 nm: n (7)., Pienempien helmien kuvantamista rajoittaa alhainen kirkkaus, mikä edellyttää erikoistuneiden tuikkuhelmien kehittämistä pienellä halkaisijalla . Koska mekanismi heräte tuike on vahvimmillaan silloin, kun palkki on suoraan puuttumatta helmi, odotamme, että tämä voi pidentää päätöslauselman loisteputki imaging suuruusluokkaa kuin, että saatavana optinen mikroskopia.