Good Mood

eredmények

kezeletlen minták. Különösen azt figyeljük meg, hogy még a nem láncolt mintákban is különbségek vannak a víz és az olajcseppek között (ábra). 1 B és C ) vagy a sejt különböző összetevői között (ábra. 1D) elegendő kontrasztot generál a megkülönböztetéshez. A sejtekben a magasabb-Z anyagok, például sók, foszfor és vas, amelyek különböző régiókban koncentrálódhatnak, javítják a kontrasztot. Fig., Az 1D egy kezeletlen kínai hörcsög petefészek (cho) sejtet mutat normál tápközegben szobahőmérsékleten. A sejt körvonala és a sejtmag belső szerkezete jól látható, csakúgy, mint a citoplazmában lévő sötét, gömb alakú részecskék sorozata. Ezeknek a részecskéknek a lipidcseppekként történő azonosítását az alábbiakban tárgyaljuk.

nehézfém festés. A felbontás és a kontraszt korlátai az alacsony-Z anyagok megfigyelésekor arra utalnak, hogy jelentős előnyök érhetők el a sejtek nagy-Z markerekkel, például elektronsűrű foltokkal vagy Nanorészecske arany címkékkel történő festésével., Valóban képesek vagyunk észlelni az arany gyöngyöket vízben 10 nm átmérőig ultravékony membránok használatával (az adatok nem jelennek meg).

a sejtekben lévő organellák Differenciálfestése az electrondense anyagokkal az EM technika standardja, bár általában nem alkalmazzák SEM-re. Fig. Az 2 a tenyésztett sejtek belsejében gazdag struktúrákat mutat, amelyeket közvetlenül a válaszfal membránján termesztettek, majd uranil-acetáttal rögzítették és festették (8). Az intracelluláris organellák jól láthatóak, beleértve a mitokondriumok belső részleteit (1.ábra). 2C ), aktin stressz rostok (ábra., 2D), valamint komplex tubuláris és citoszkeletális struktúrák (ábra. 2 A és B). A magasabb gerenda energia ábra. 2C szondák belső szerkezete, míg alacsonyabb energia (ábra. 2D), a membrán közelében lévő felület láthatóvá válik. Így különböző energiák használhatók háromdimenziós információk megszerzésére.

Nanorészecske arany markerekre vonatkozik. A detektálás nagy felbontása és specifikussága antitestek vagy más ligandumok kötődésével érhető el., Más EM módszerekhez hasonlóan a címkézés a legkényelmesebb az arany nanorészecskék használatával. Az EM (TEM) transzmisszióval ellentétben, amely csak nagyon vékony és gyakran önkényes szakaszokat vesz fel, a wet SEM lehetővé teszi a gyors váltást a helyi és globális nézet között az egész cellában történő címkézésről. Fig. 3 A és B megmutatja, hogyan használták fel a 40 nm-es nanorészecskés arany címkével ellátott monoklonális antiepidermális növekedési faktor receptor antitesteket az epidermális növekedési faktor receptorok intakt a431 rákos sejteken történő címkézésére., A rögzítés gyakran hasznos és kényelmes még nedves SEM, és megkönnyítheti a címkézés, valamint az átadás a mikroszkóp. Az itt bemutatott sejteket uranil-acetáttal is festették, amely lehetővé teszi a címkézett receptorok összehangolását a sejtek általános szerkezetével. A nanorészecskék nagy kontrasztú és egységes mérete egyértelmű azonosítást és lokalizációt tesz lehetővé. Az egyes receptor molekulák pontos lokalizációjának ismerete lehetővé teszi az olyan események mérését, mint az epidermális növekedési faktor által kiváltott receptor dimerizáció., A cellák festése nem szükséges a címkézéshez, ezért egy nem láncolt, címkézett cellák képét is felvettük (1.ábra). 7, amely a PNAS honlapján támogató információként jelenik meg). Szintén látható egy kép, amely azt mutatja, hogy a cella belső részeinek jelölése lehetséges (ábra. 8, amely a PNAS webhelyén támogató információként jelenik meg), ebben az esetben a mitokondriumok arany gyöngyökkel történő megjelölése. A sejtek belsejében lévő aktinszálak címkézését a szubnanométer aranyrészecskék használatával is elérték, majd ezüst fokozással (az adatok nem jelennek meg).

a baktériumok arany címkézésének példája az ábrán látható. 3C . Itt a Helicobacter pylori (9) feltételezett gasztrin receptorát biotinilált gasztrin és sztreptavidin-bevonatú, 20 nm-es arany nanorészecskék komplexeivel történő inkubálással detektálják. A biotinilezett gasztrin beadása a sztreptavidinnel bevont arany előtt szinte nem eredményezett nanorészecskéket a baktériumhoz. Ezt az eredményt a két lépés közötti időtől függetlenül kaptuk, ami arra utal, hogy a gasztrin felvétele a H. pylori-ba szinte azonnali., Az a tény, hogy a komplex gasztrin nem lépett be a sejtekbe, arra utal, hogy meghatározható a baktériumok által internalizálható részecskék méretének határa.

képalkotó technikák összehasonlítása (Trypanosoma brucei). Hasznos összehasonlítani ezt a technológiát a meglévő képalkotó technikákkal egy Modellrendszer segítségével. Egy ilyen tanulmányt az ábra részletez. 4, a parazita T. brucei prociklikus forma, amely a tsetse légy közepén terjed. Az első három kép a meglévő képalkotási módokat jeleníti meg: optikai fluoreszcens mikroszkópia (ábra., 4A), differenciális interferencia kontraszt mikroszkópia (ábra. 4B), és TEM (ábra. 4C). A meglévő technikák erőssége nyilvánvaló: lokalizált jelölés fluoreszcenciában és részletes szakaszok a TEM-ben. A kezeletlen optikai (ábra. 4B) és nedves SEM (ábra. 4D) a képek körvonalazzák a cella határait, de alacsony kontrasztúak és részlettelenek. Mindkettő hangsúlyozza a magot, de a differenciálinterferencia kontrasztképben megjelenő egyéb organellákat nem egyértelműen azonosítják, míg a nedves SEM kép előnyére hozza ki a lipidcseppeket. Ozmium-tetroxid festés (ábra., 4E) nem olyan hasznos ebben a rendszerben, hangsúlyozva leginkább a lipid cseppek és néhány azonosítatlan belső organellák. A legerősebb képalkotás látható ábra. 4F, amelyhez uranil-acetát festést alkalmaztak. Az intakt képalkotás előnye, amellyel a teljes sejt látható (a finom belső struktúrákkal együtt, amelyek részletesen megfigyelhetők), nyilvánvaló, különösen a TEM képalkotáshoz képest (ábra. 4C). Végül, nedves SEM képalkotó teljes-sejt-specifikus jelölés elleni antitestek az őrnagy glycosylphosphatidylinositol-horgonyzott felület kabát fehérje EP procyclin (10) ábrán látható., 4 G és H . Érdekes módon az EP procyclinről ismert, hogy egyenletesen lefedi az egész cellát, de a megfigyelt jel fürtözött. Ezt annak tulajdonítjuk, hogy az alapul szolgáló lipid tutajok hajlamosak az antitestek hatására klaszterezni, ezt a folyamatot a formaldehidben való rögzítés nem képes megakadályozni. Az arany markerek a sejt háromdimenziós konformációját oly módon is megvilágítják, amely emlékeztet arra, amit a standard SEM képes képezni (T. brucei kiváló, reprezentatív SEM képe megtalálható a http://tryps.rockefeller.edu/crosslab_intro.html).

nyilvánvaló, hogy a TEM általában jobb felbontású lesz, mint a nedves SEM, de a T. brucei példájában bemutatott képek összehasonlításra” tipikus ” képek ugyanabban a laboratóriumban., Mivel a wet SEM hasznossága különbözik a TEM-től és az optikai mikroszkópiától, a T. brucei-ben fontos kiegészítő képességnek tekinthető, és elvárható, hogy a teljes képet optikai, TEM és nedves SEM technika kombinációjával adják meg.

Szövetszelvények. A nedves SEM vastag példányokhoz, például szövetdarabokhoz használható, ha a mintát egyszerűen a membránhoz rögzíti. A BSEs korlátozott mintavételi mélysége lehetővé teszi egy “virtuális szakasz” képalkotását, amely a felületről néhány mikrométer meghatározott mélységig terjed, vékony metszés nélkül.,

ábra. Az 5 A és B a kezeletlen szövetek egérből történő közvetlen megjelenítését mutatja. Fig. Az 5A a szívszövet kis nagyítású képe. Az izomsejtek szervezése nyilvánvaló. Nagyítás egy cellára (ábra. 5B) élénk képet ad a sejtmagról és az intracelluláris organellumokról, esetleg a mitokondriumokról, valamint azok eloszlásáról a sejtben. Amint az a fenti tenyésztett sejtek, festés szövetek előnyös, de nem feltétlenül, és fokozhatja a vizualizáció számos jellemzője. Fig. 5 C és D egy patkány vese kéregének egy részét mutatja., A festés (kálium-ferricianid) a vesetubulusok epitheliáján belüli általános szerveződést és sejtkapcsolatokat hangsúlyozza. A festés és a képalkotás körülményeinek gondos beállítása különböző és kiegészítő információkat, például szöveti architektúrát fedhet fel; például az uranil-acetáttal festett szövetek egyértelmű képet adnak az extracelluláris mátrixról (az adatok nem jelennek meg).

egyidejű Fotongyűjtemény (Cl). A BSE kimutatása nedves SEM-ben kiegészíthető a fotonok egyidejű gyűjtésével., A pásztázó elektronsugár gerjeszti a mintában lévő molekulákat, amelyek ezután jellegzetes hullámhosszon (CL) fényt bocsáthatnak ki. A fényintenzitást ezután a szcintilláló molekulák eloszlásának képének levezetésére használják, akár endogén a sejtre, akár az extranálisan bevezethető címkékre. Ezt a képet a BSE képalkotásával egyidejűleg kapjuk elektronanyag–kölcsönhatások által korlátozott felbontásban, nem pedig fény diffrakcióval (6). A minta alatti folyadékba egy fényvezetőt helyeztünk be, amely a kibocsátott fényt egy fotomultiplierhez irányítja., Ez a beállítás lehetővé teszi az elektronsugár által gerjesztett fotonok jó összekapcsolását és hatékony gyűjtését anélkül, hogy veszélyeztetné az egyidejű BSE detektálás hatékonyságát.

ábra. 6 a kezeletlen CHO-sejteket mutatja, amelyeket a BSE és a fotonok egyidejűleg vizualizálnak. A Füge. 6a, a sejthatárok egyértelműen az elektron-képalkotó módban vannak körvonalazva, a mag (a nukleolokkal együtt) kiemelkedő, csakúgy, mint a mag körül lévő sötét ≈1 µm foltok. Ezek az összes vizsgált eukarióta sejt citoplazmájában jelennek meg, és bár számuk változó, általában a mag körül szétszóródnak., A Cl képen látható ábra. A 6b, a sejtvázlat és a sejtmag egyértelműen meghatározott, ami a szcintilláló molekulák (hasonlóan az autofluoreszcenciához) eloszlását jelzi a sejtben. Ebben a módban ugyanazokat a foltokat jellemzi a fotonok nagy kibocsátása. A magas katodolumineszcens jel és a magas széntartalom kombinációja jellemző a lipidcseppekre (11), amelyek részt vesznek a sejt energiatárolásában (12)., A 200 µM-es olajsav hozzáadásának független vizsgálata Ezen cseppek erős proliferációját okozta a sejtben (az adatok nem jelennek meg), összhangban azzal a gondolattal, hogy a megfigyelt foltok lipidcseppek.

a nedves SEM előnye a szokásos SEM technikákkal szemben a lipidek megőrzésében, különösen nagy aggregátumokban, például lipidcseppekben. A szárítás szükségességének kiküszöbölése megmenti a lipideket a szerves oldószerektől, amelyek feloldhatják őket. Bár az ozmiumkezelés megőrzi néhány lipid kétréteget, nagyobb aggregátumokban az ozmium gyorsan reagál egy külső kéreg létrehozására, amely nem engedi az ozmiumot, így az aggregátumok sebezhetőek a későbbi szerves oldószeres kezeléssel szemben., A kriogén készítményekben a hasítási folyamat hajlamos a lipid–víz határai mentén feltörni, ami szintén veszélyt jelent a nagy lipidszerkezetekre.

a markerek nagy felbontású képalkotása a CL detektálási mód rendkívül kívánatos képessége, amely a cellákban lévő specifikus molekulák címkéinek kifejlesztését igényli. A Füge. 9, amely a PNAS honlapján támogató információként jelenik meg, azt mutatjuk be, hogy a 0,2 µm átmérőjű szabványos fluoreszkáló gyöngyök intenzíven bocsátanak ki fotonokat az elektronsugár alatt, és ≈100 nm (7) felbontással imagálhatók., A kisebb gyöngyök képalkotását az alacsony fényerő korlátozza, ami kis átmérőjű speciális szcintillációs gyöngyök kifejlesztését vonja maga után . Mivel a szcintilláció gerjesztésének mechanizmusa a legerősebb, ha a gerenda közvetlenül a gyöngyre ütközik, arra számítunk, hogy ez meghosszabbíthatja a fluoreszkáló képalkotás felbontását egy nagyságrenddel, amely meghaladja az optikai mikroszkóppal rendelkezésre álló felbontást.