Det krever en reell innsats for å holde din grunnleggende kunnskap i molekylær-og cellebiologi frisk, i tillegg til alt annet du har å gjøre. Ville det ikke være flott hvis det var et sted hvor du kunne finne lett-å-lese artikler som tillater deg å friske opp på disse grunnleggende i bare et par minutter?
…jeg håper du sa «ja», fordi dette er målet for min «Det Grunnleggende:» – serien av artikler, som vi allerede har, og vil fortsette å bringe til deg med jevne mellomrom. Denne artikkelen forklarer det grunnleggende av DNA ligation.,
DNA Ligation Buddy: DNA Ligase
DNA ligase (EF 6.5.1.1) er enzymet i hjertet av DNA ligation reaksjon. Det covalently blir fosfat ryggraden i DNA med sløv eller kompatibel helhetlig ender (se Figur 1), og det er naturlig rolle i å reparere dobbeltrom strand brudd i DNA-molekyler. I molekylær biologi det er ofte brukt for innsetting av restriction enzym-generert DNA-fragmentet i vektoren infrastruktur. Kommersielle ligases leveres med en reaksjon buffer som inneholder ATP og Mg2+, som begge er avgjørende for ligase aktivitet., Siden ATP kan bli skadet ved gjentatte fryse-tine sykluser, det er tilrådelig å gjøre alikvoter av buffer (se min artikkel «5 DNA ligation tips»).
Figur 1. Helhetlig og butte ender, klar for DNA ligation!
De to trinnene i DNA-ligation reaksjon
DNA ligation selve reaksjonen har to grunnleggende trinn. For det første DNA-endene til å møtes ved en tilfeldighet, og holde sammen lenge nok til at ligase til å bli med dem. Dette er den mest ineffektive del av reaksjonen, men er enklere ved lave temperaturer. Hvorfor?, Vel, som du sikkert vet, alle molekylene bevege seg raskere ved høyere temperaturer, så du kan forestille meg at det kommer til å bli enklere for to DNA-endene til å møtes, og bo sammen hvis de er skånsomt flyter gjennom løsning på lav temperatur, snarere enn runde som om de ville være ved høyere temperaturer. For sammenhengende ender, det er en ekstra grunn; lavere temperaturer stabilisere hydrogenbinding mellom komplementære nukleotider, som virkelig hjelper til å holde ting på plass.
Figur 2., Enzymatisk reaksjon av DNA ligation
Det andre trinnet er enzymatisk reaksjon, som er vist skjematisk i Figur 2.. DNA ligase catalyzes det å bli i 3′-OH til 5′-fosfat via en to trinn mekanisme. Første, AMP nukleotid, som er festet til en lysin rester i enzymet er aktivt nettstedet, er overført til 5′-fosfat. Deretter AMP-fosfat bond er angrepet av 3′-OH, forming covalent bond og slippe AMP. Å tillate enzymet å gjennomføre ytterligere reaksjoner AMP i enzymet er aktivt nettstedet må være oppfylt av ATP.,
Her er hvorfor vi utføre DNA-Ligation ved lave temperaturer kan hjelpe
DNA ligase enzymet har optimal aktivitet ved 25°C så ligation reaksjon er utført ved en temperatur som er en trade-off mellom den optimale temperaturer for å DNA-endene sammen (1°C) og enzymatisk reaksjon (25°C). Normalt 1 time på 16°C er fint, men siden bringe DNA endene sammen er den minst effektive del av reaksjonen å favorisere dette ved å senke temperaturen 4°C kan gi en enda mer effektivitet. Imidlertid, enzymet vil fungere svært langsomt ved denne temperaturen så lang (f.eks., over natten) inkubasjonstid er nødvendig.
Opprinnelig publisert 31. oktober 2007; oppdatert og republisert på 5 desember 2014.
Har dette hjulpet deg? Så vær så snill å dele med nettverket.
