DISKUSJON
gramfarging er den mest brukte fargeprosess i bakteriologi. Det kalles en differensial flekken siden det skiller mellom Gram-positive og Gram-negative bakterier. Bakterier som flekken lilla med Gram-farging prosedyren kalles Gram-positive; de som flekken rosa er sagt å være Gram-negative. Det gjelder positive og negative, har ingenting å gjøre med elektrisk ladning, men rett og slett utpeke to forskjellige morfologiske grupper av bakterier.,
Gram-positive og Gram-negative bakterier flekken annerledes på grunn av fundamentale forskjeller i strukturen av sine cellevegger. Den bakterielle cellevegg tjener til å gi organismen sin størrelse og form, samt for å hindre osmotisk lyse. Materialet i den bakterielle cellevegg som gir stivhet er peptidoglycan.
I electron mikrografer, Gram-positive cellevegg vises som en bred, tett vegg 20-80 nm tykk og består av flere sammenhengende lag av peptidoglycan (Figur 1A og 1B). Kjemisk, 60 til 90% av den Gram-positive celleveggen er peptidoglycan., Vevet inn i cellen vegg av Gram-positive er teichoic syrer. Teichoic syrer, som strekker seg gjennom og utover resten av cellen vegg, er sammensatt av polymerer av glyserol, fosfat, sukker og alkohol ribitol. Noen har et lipid vedlagt (lipoteichoic syre). Den ytre overflaten av peptidoglycan er spekket med proteiner som varierer med belastningen, og arter av bakterien.,
Den Gram-negative cellevegg, på den annen side inneholder bare 2-3 lag av peptidoglycan og er omgitt av en ytre membran som består av fosfolipider, lipopolysaccharide, lipoprotein og proteiner (Figur 2A og 2B). Bare 10% – 20% av Gram-negative celleveggen er peptidoglycan. Fosfolipider er i hovedsak lokalisert i indre lag av den ytre membran, som er den lipoproteiner som kobler den ytre membranen til peptidoglycan., Den lipopolysaccharides, som ligger i det ytterste laget av den ytre membranen, som består av et lipid delen som kalles lipid Et integrert i membranen og et polysakkarid del som strekker seg utover fra bakteriell overflaten. Den ytre membranen inneholder også en rekke proteiner som varierer med belastningen, og arter av bakterien.,
For mer informasjon om Gram-negative og Gram-positive cellevegg, kan du se følgende Læring Objekter i din Foredrag Guide:
- Prokaryotic Celle Veggen, Unit 1, Seksjon IIB2
- Den Gram-Positive Celle Veggen, Unit 1, Seksjon IIB2a
- Den Gram-Negative Celle Veggen, Unit 1, § IIB2b
Den Gram-farging prosedyren innebærer fire grunnleggende fremgangsmåte:
1. Bakterier er første farget med grunnleggende farge crystal violet. Både Gram-positive og Gram-negative bakterier blir direkte farget og vises lilla etter dette trinnet.,
2. Bakterier er deretter behandlet med Gram er jod-løsning. Dette gjør at presset skal beholdes bedre ved å danne et uløselig crystal violet-jod-komplekset. Både Gram-positive og Gram-negative bakterier er fortsatt lilla etter dette trinnet.
3. Gram ‘ s decolorizer, en blanding av etanol og aceton, deretter legges. Dette er differensial trinn. Gram-positive bakterier beholde crystal violet-jod komplekse mens de Gram-negative er decolorized.
4. Til slutt, counterstain safranin (også en grunnleggende farge) er anvendt., Siden den Gram-positive bakterier er allerede farget lilla, de er ikke berørt av counterstain. Gram-negative bakterier, som nå er fargeløs, blir direkte farget av th e safranin. Dermed, Gram-positive vises lilla, og Gram-negative vises rosa.
© Daniel Cavanaugh, Mark Ivrig, forfattere, Lisensiert for bruk, ASM MicrobeLibrary.,
Med den gjeldende teorien bak Gram-farging, det er antatt at i Gram-positive bakterier, crystal violet og jod kombineres for å danne et større molekyl som svikter ut i cellen. Alkohol/aceton blandingen deretter fører til dehydrering av flerlags peptidoglycan, og dermed redusere avstanden mellom molekyler og forårsaker celleveggen til å felle crystal violet-jod-komplekset i cellen., I tilfelle av Gram-negative bakterier, alkohol/aceton blandingen, blir et lipid løsemiddel, oppløser den ytre membran av cellen vegg, og kan også skade den cytoplasmatiske membranen som peptidoglycan er festet. De få lag av peptidoglycan er i stand til å beholde crystal violet-jod-kompleks, og cellen er decolorized.
Det er viktig å merke seg at Gram-positivitet (evne til å beholde den lilla krystall fiolett-jod-komplekset) er ikke en alt-eller-ingenting fenomen, men et spørsmål om grad., Det er flere faktorer som kan resultere i en Gram-positive organismer farging, Gram-negativ:
1. Metode og teknikker som brukes. Overoppheting under varme fiksering, over decolorization med alkohol, og selv for mye vasking med vann mellom trinnene kan resultere i Gram-positive bakterier å miste crystal violet-jod-komplekset.
2. I en alder av kultur. Kulturer mer enn 24 timer gamle, kan miste sin evne til å beholde crystal violet-jod-komplekset.
3. Organismen i seg selv., Noen Gram-positive bakterier er mer i stand til å beholde crystal violet-jod komplekse enn andre.
Derfor, må man bruke veldig presise teknikker i Gram-farging og tolke resultatene med skjønn.
Trypticase Soy agar plate kulturer av Escherichia coli (en liten, Gram-negative bacillus) og Staphylococcus epidermidis (en Gram-positiv coccus med en staphylococcus ordning).
PROSEDYRE (gjøres individuelt)
1., Escherichia coli
en. Varme-fix smør et tynt av Escherichia coli som følger:
1. Ved hjelp dropper flaske av deionisert vann som finnes i din farging rack, sted 1/2 av normal størrelse dråpe vann på en ren lysbilde ved å trykke dropper å dekselet (Figur 1). Altenately, bruke din sterilisert inoculating loop for å plassere en dråpe av deionisert vann på lysbildet.
2., Ved hjelp av din sterilt inoculating loop, aseptisk fjerne en liten del av kulturen fra agar-overflate-og berører det 2 – 3 ganger til slipp av vann til vannet blir synlig overskyet (Figur 2). En god smøre med riktig mengde bakterier er viktig å Gram-farging.
- For mange bakterier på lysbildet kan resultere i under-decolorization; for noen kan føre til over-decolorization.
3. Brenne de gjenværende bakterier på inoculating loop., Hvis for mye kultur er lagt til vannet, vil du ikke se farget enkelte bakterier og du kan ikke ha en pålitelig gramfarging.
4. Etter inoculating loop kjøler, spre suspensjon over ca halvparten av lysbildet for å danne en tynn film. En riktig forberedt smøre med den rette mengden av bakterier bør se omtrent slik Fig. 3.
5. La denne tynne suspensjon til helt tørr luft (Figur 4). Den smøre må være helt tørt før dekselet er varme løst!
6., Til varme-fix bakterier til lysbildet,plukke opp air-tørket lysbilde med dekkglass pinsett og hold bunnen av dekselet overfor smøre nærheten åpningen av microincinerator i 10 sekunder (Figur 5) som vist av din instruktør. Hvis dekselet er ikke oppvarmet nok, alt av bakterier vil vaske av. Hvis det er overopphetet, bakterier strukturelle integritet kan bli skadet.
b. Flekken med Hucker ‘ s crystal violet for en liten (Figur 6). Forsiktig vask med vann (Figur 7). Rist av overflødig vann, men ikke tørk mellom trinnene.
c., Flekken med Gram er jod-løsning for en liten (Figur 8) og forsiktig vask med vann.
d. Decolorize ved å plukke opp dekselet og la Gram er decolorizer kjøre ned skyv til de lilla bare stopper, flyter av sted i bunnen av dekselet (Figur 9).
- sørge for at hele smøre er jevnt decolorized og at du ikke er under-decolorizing eller over-decolorizing.
- Vask straks med vann.
e. Flekken med safranin for en liten (Figur 10)., Når du vasker av overskytende safranin, være svært forsiktig med å vaske forsiktig og kort som det er mulig å vaske ut noen av de sarfanin i bakterien.
– f. Klapp tørt (Figur 11), og følg med olje nedsenking mikroskopi.
2. Staphylococcus epidermidis
en. Varme-fix smør et tynt av Staphylococcus epidermidis som følger:
1. Ved hjelp dropper flaske av deionisert vann som finnes i din farging rack, sted 1/2 av normal størrelse dråpe vann på en ren lysbilde ved å trykke dropper å dekselet (Figur 1)., Altenately, bruke din sterilisert inoculating loop for å plassere en dråpe av deionisert vann på lysbildet.
2. Ved hjelp av din sterilt inoculating loop, aseptisk fjerne en liten del av kulturen fra agar-overflate-og berører det 2 – 3 ganger til slipp av vann til vannet blir synlig overskyet (Figur 2).
- For mange bakterier på lysbildet kan resultere i under-decolorization; for noen kan føre til over-decolorization.
3. Brenne de gjenværende bakterier på inoculating loop., Hvis for mye kultur er lagt til vannet, vil du ikke se farget enkelte bakterier og du kan ikke ha en pålitelig gramfarging.
4. Etter inoculating loop kjøler, spre suspensjon over ca halvparten av lysbildet for å danne en tynn film (Figur 3).
5. La denne tynne suspensjon til helt tørr luft (Figur 4). Den smøre må være helt tørt før dekselet er varme løst!
6., Til varme-fix bakterier til lysbildet,plukke opp air-tørket lysbilde med dekkglass pinsett og hold bunnen av dekselet overfor smøre nærheten åpningen av microincinerator i 10 sekunder (Figur 5) som vist av din instruktør. Hvis dekselet er ikke oppvarmet nok, alt av bakterier vil vaske av. Hvis det er overopphetet, bakterier strukturelle integritet kan bli skadet.
b. Flekken med Hucker ‘ s crystal violet for en liten (Figur 6). Forsiktig vask med vann (Figur 7). Rist av overflødig vann, men ikke tørk mellom trinnene.
c., Flekken med Gram er jod-løsning for en liten (Figur 8) og forsiktig vask med vann.
d. Decolorize ved å plukke opp dekselet og la Gram er decolorizer kjøre ned skyv til de lilla bare stopper, flyter av sted i bunnen av dekselet (Figur 9).
- sørge for at hele smøre er jevnt decolorized og at du ikke er under-decolorizing eller over-decolorizing.
- Vask straks med vann.
e. Flekken med safranin for en liten (Figur 10)., Når du vasker av overskytende safranin, være svært forsiktig med å vaske forsiktig og kort som det er mulig å vaske ut noen av de sarfanin i bakterien.
– f. Klapp tørt og observere ved hjelp av olje nedsenking mikroskopi.
3. Kontroller at du er nøye med hell brukes fargestoff i din farging skuff i avfall fargestoff prøvetakingsrøret, ikke ned i vasken.
© Hussein Shoeb, forfatter. Lisensiert for bruk, ASM MicrobeLibrary.
B., KAPSELEN FLEKKEN
DISKUSJON
Mange bakterier skille ut en slimete, tyktflytende som dekker kalles en kapsel eller glycocalyx . Dette er vanligvis sammensatt av polysakkarid, polypeptid, eller begge deler.
evnen til å produsere en kapsel er en arvelig egenskap av organismen, men kapselen er ikke en absolutt nødvendig mobil komponent. Kapsler er ofte produsert bare under spesielle vekstforhold. Selv om ikke avgjørende for livet, kapsler p robably hjelpe bakterier for å overleve i naturen., Kapsler hjelpe mange patogene og normale bakterier flora til å begynne motstå phagocytosis av verten er phagocytic celler. I jord og vann, kapsler bidra til å hindre bakterier fra å bli oppslukt av protozoans. Kapsler også hjelpe mange bakterier å forholde seg til overflater og dermed motstå rødme. Det gjør det også mange bakterier for å danne biofilm. En biofilm lag består av bakterielle bestander følge vert celler og forankret i en felles capsular masse.,
For ytterligere informasjon om bakteriell kapsler, kan du se følgende Læring Objekter i din Foredrag Guide:
- Glycocalyx (Kapsel) og S-Lag; Stykk 1, § IIB4a
- Evne til å Motstå Phagocytic Engulfment; Enhet 3, § B5b
ORGANISMEN
Skummet Melk buljong kultur av Enterobacter aerogenes. Skummet melk leverer viktige næringsstoffer for kapsel produksjon, og gir også en litt stainable bakgrunn.
PROSEDYRE (gjøres individuelt)
1., Rør opp Skummet Melk buljong kultur med sløyfe og sted 2-3 ledd av Enterobacter aerogenes på et mikroskop lysbilde.
2. Ved hjelp av din inoculating loop, spre eksempel ut til å dekke omtrent en tomme av dekselet.
3. La det lufttørke fullstendig tørr. Ikke varme fikse. Kapsler stick godt til glass, og varme kan ødelegge kapsel.
4. Flekken med crystal violet for ett minutt.
5. Vask av overflødig farge med 20% kobber sulfat løsning.
6. Rist av overflødig kobber sulfat løsning og umiddelbart klapp tørt.
7. Observere ved hjelp av olje nedsenking mikroskopi., Organismen og melk tørket på lysbildet vil plukke opp den lilla fargestoff mens kapselen vil være fargeløs.
8. Kontroller at du er nøye med hell brukes fargestoff i din farging skuff i avfall fargestoff prøvetakingsrøret, ikke ned i vasken.
9. Observere demonstrasjon kapsel preget av Streptococcus lactis , innkapslet bakterien som er normal flora i melk.
A. gramfarging
Lag tegninger av hver bakterie på gramfarging forberedelse.,
|
|
|
| Color = Gram reaction = Shape = |
Color = Gram reaction = Shape = Arrangement = |
B., Kapselen Flekken
Lag en tegning av din kapsel flekken utarbeidelse av Enterobacter aerogenes og demonstrasjon kapsel preget av Streptococcus pneumoniae.
Kapsel preget av
Streptococcus lactis
