Oppdagelsen av Mitokondrie-DNA
Noen begreper ta den vitenskapelige verden med storm, men andre erobre det bare etter mange trefninger. Oppdagelsen av mitokondrie DNA (mtDNA) tilhører den andre kategorien. Biochemists, histologists, og elektron microscopists hadde sett DNA i mitokondriene i år, men de fleste av dem var ikke klar for den ideen at DNA virkelig tilhørte det. Dette kan forklare hvorfor lærebok kontoer mtDNA nesten aldri fortelle hvordan denne DNA ble oppdaget.,
Etter den grunnleggende bebyggelsesplan av den eukaryote celle hadde blitt avslørt i begynnelsen av 1950-tallet av elektronet mikrografer av Palade, Sjöstrand, og andre, biochemists omfavnet de Duve ‘ s dogma at hver macromolecule hadde ett, og bare ett, intracellulære beliggenhet. I analysen av cellen fraksjoner, cytokrom oksidase ble tatt som en markør for mitokondrier, nicotianamide adenine dinucleotide fosfat (NADPH)–cytokrom c reduktase for endoplasmic reticulum, og DNA for kjernen., Gitt denne rammen av tankene, er det lett å forstå hvorfor tilstedeværelse av DNA i mitokondrie fraksjoner var generelt knyttet til forurensning av kjernefysisk fragmenter. Histochemical DNA flekker, for eksempel Feulgen reaksjon, også farget det kinetoplasts av Trypanosomes og ‘Nebenkern’ av insekt spermatozoa, men på den tiden var det ennå ikke anerkjent at disse strukturene, faktisk var uvanlig mitokondrier., Enorme mengder extranuclear DNA ble også påvist i cytoplasma av amfibier dem, men det tok mange år å innse at dette DNA var, faktisk, mtDNA som har overflod skyldes den enorme mengden mitokondrier i disse store celler. I 1961, på den Femte Årlige Møtet i American Society of Cell Biology i Chicago, Hans Ris viste electron mikrografer av mitokondrier med inneslutninger likner DNA-inneholder nucleoids av bakterier og gjort den kjetterske forslag om at mitokondriene (og også chloroplasts), inneholder sitt eget DNA., I en artikkel som dukket opp i de følgende år, Ris og Walter S Plaut ytterligere dokumentert og utvidet disse observasjonene. Snart etterpå, biokjemiske og morfologiske bevis fra flere grupper bekreftet tilstedeværelse av DNA i chloroplasts.
oppdagelsen av chloroplast DNA-laget biochemists ta en titt på tidlige funn av Margaret Mitchell og Boris Ephrussi at visse mutasjoner som påvirker mitokondrienes funksjon i formen Neurospora crassa og gjæren Saccharomyces cerevisiae var ikke arvet i henhold til Mendel ‘ s lover., Det virket fristende å spekulere i at den ukjente ‘extrachromosomal faktorer’ innblandet i disse mutasjonene, faktisk var mtDNA.
Etter 1962, bakken for konseptet mtDNA var dermed godt forberedt, men konseptet i seg selv var ikke allment akseptert. I ettertid, ser det ut til at det vitenskapelige samfunnet var i vente for overbevisende studier som dokumenterte eksistensen av mtDNA av flere ulike metoder.
En av disse studiene kom fra electron microscopists Margit MK Nass og Sylvan Nass, som da var i arbeid på Wenner Gren Institutt ved Universitetet i Stockholm., De viste at matrisen av osmium-faste kylling embryo mitokondrier finnes tråden-som inneslutninger hvis utseende etter ulike fiksering prosedyrer tett parallell som histone-gratis DNA nucleoid av bakterier: etter fiksering med osmium tetroxide, den inkluderinger dukket opp klumpet seg og som barer med en diameter på ~400 Å; fiksering av vev med osmium tetroxide etterfulgt av behandling med uranyl acetate før dehydrering gjort dem vises som 15-30-Å tynne fibre., Enda mer overbevisende bevis for tilstedeværelse av DNA i disse inkluderinger var den observasjon at inneslutninger kan fjernes ved behandling av lett fast embryonale vev med DNase. Behandling med pepsin, med RNase, eller med DNase-gratis buffer kontrollene var ineffektive. Klarhet i disse electron mikrografer og forsiktig kontroller som ble inkludert hadde en overbevisende effekt på celle biologer. MMK Nass og S Nass publiserte sitt arbeid i to back-to-back papirene i en 1963-utgaven av Journal of Cell Biology., På den tiden, men, cellebiologi og biokjemi var fortsatt ganske ulike disipliner og mest biochemists ikke lese tidsskrifter som er viet cellebiologi. Det er derfor tok det en stund før resultatene av MMK Nass og S Nass inn i bevisstheten til den biokjemiske samfunnet.
omtrent På samme tid, Ellen Haslbrunner, Hans Tuppy, og Schatz ved Biokjemisk Institutt ved Universitetet i Wien, var å prøve å finne en biokjemisk grunnlag for extrachromosomal mutasjoner som avskaffet lungefunksjon i gjær S. cerevisiae., I begynnelsen av 1960-tallet, mange biochemists var fortsatt vanskelig å vurdere hvilken » luftveier partikler av gjær som bona fide mitokondrier, som er plassert forskning ved Haslbrunner et al. vel utenfor hovedstrømmen av mitokondrie biokjemi i Usa og andre steder.
for Å se etter DNA i mitokondriene, en biokjemisk tilnærming ble valgt. Gjær mitokondriene ble renset av de beste metodene tilgjengelig, og deres DNA innholdet ble målt ved hevdvunne ‘Diesche’ farge reaksjon., Noen år før, de Duve og co-arbeidere hadde vist at sentrifugere subcellular fraksjoner til likevekt i en tetthet gradient ofte ga en ren separasjon av ulike organeller. Overraskende, den vanlige sukrose graderinger ikke separat gjær mitokondrier fra en kjernefysisk fragmenter, men når sukrose ble erstattet med X-ray kontrasterende agent ‘Urografin’, mitokondrier dannet en ekstremt skarp band, og DNA var til stede i bare to fraksjoner: de fleste var på bunnen av sentrifuger røret, og en svært liten mengde, men diskret peak falt sammen akkurat som mitokondrier., DNA-et i bunnen brøkdel var lett fordøyd av DNase og tilsynelatende representert kjernefysiske DNA. DNA-et i mitokondrie brøkdel var ikke lett fordøyd av DNase mindre organeller først ble forstyrret med trekloredikksyre; antagelig, det representerte DNA omsluttet av mitokondrie membraner. Konsentrasjonen var veldig konstant mellom forskjellige eksperimenter – mellom 1 og 4 µg mg−1 mitokondrie protein. Urografin – renset mitokondrier fra rat leveren, rotte nyre, og storfe hjerte – finnes nesten 10 ganger mindre DNA, mellom 0,2 og 0,6 µg DNA per mg protein., Den typiske mammalske mitokondrium var beregnet til å inneholde 3 × 10-17 g DNA. Forutsatt at DNA var dobbel-strandet, det kunne kodes ikke mer enn 1,2 MDa av polypeptid kjeder. Dette resultatet ble ansett som viktig, fordi den fast utelukket muligheten for at mtDNA kodet alle mitokondrie proteiner. I dag, har denne tidlige beregning av Haslbrunner et al. kan bli utfordret på flere grunnlag, men det kom utrolig nær virkeligheten: 13 polypeptides kodet av nukleære mtDNA har en total masse på 0.,423 MDa, og resten av koding potensialet er i stor grad forklares med gener for ribosom og overføre RNAs, så vel som av det faktum at mitokondriene har vanligvis mer enn én kopi av DNA-genom.
