det tar en verklig ansträngning att hålla din grundläggande kunskap om molekylär och cellbiologi fräsch, förutom allt annat du behöver göra. Skulle det inte vara bra att om det fanns en plats där du kunde hitta lättlästa artiklar som gör att du kan borsta upp på dessa grunder på bara några minuter?
…Jag hoppas att du sa ”ja”, för det här är syftet med min ”grunderna:” serie artiklar, som vi redan har, och kommer att fortsätta att, ta med dig regelbundet. Denna artikel förklarar grunderna i DNA-ligering.,
din DNA-Ligationskompis: DNA-ligas
DNA-ligas (EC 6.5.1.1) är enzymet i hjärtat av DNA-ligeringsreaktionen. Det förenar kovalentt fosfat ryggraden i DNA med trubbiga eller kompatibla kohesiva ändar (se Figur 1) och det är naturligt roll är att reparera dubbla strängbrott i DNA-molekyler. I molekylärbiologi används det ofta för införande av restriktionsenzymgenererade DNA-fragment i vektorben. Kommersiella ligaser levereras med en reaktionsbuffert innehållande ATP och Mg2+, som båda är väsentliga för ligasaktivitet., Eftersom ATP kan skadas av upprepade frystningcykler, är det lämpligt att göra alikvoter av bufferten (se min artikel ”5 DNA-ligeringstips”).
Figur 1. Sammanhängande och trubbiga ändar, redo för DNA-ligering!
de två stegen i DNA-ligeringsreaktionen
DNA-ligeringsreaktionen i sig har två grundläggande steg. För det första måste DNA-ändarna kollidera av en slump och hålla ihop tillräckligt länge för ligasen att ansluta sig till dem. Detta är den mest ineffektiva delen av reaktionen, men är lättare vid låga temperaturer. Varför?, Tja, som du förmodligen vet, rör sig alla molekyler snabbare vid högre temperaturer så att du kan föreställa dig att det kommer att bli lättare för två DNA-ändar att kollidera och hålla ihop om de försiktigt flyter genom lösningen vid låg temperatur, snarare än att whizzing om som de skulle vara vid högre temperaturer. För sammanhängande ändar Finns det ytterligare en anledning; lägre temperaturer stabiliserar vätebindningen mellan de kompletterande nukleotiderna, vilket verkligen hjälper till att hålla saker på plats.
Figur 2., Enzymatisk reaktion av DNA-ligering
det andra steget är den enzymatiska reaktionen, som visas schematiskt i Figur 2.. DNA-ligas katalyserar sammanfogningen av 3′-OH till 5 ’ – fosfat via en tvåstegsmekanism. För det första överförs AMP-nukleotiden, som är fäst vid en lysinrester i enzymets aktiva plats, till 5 ’ – fosfat. Därefter attackeras AMP-fosfatbindningen av 3 ’ – OH, som bildar den kovalenta bindningen och frigör AMP. För att enzymet ska kunna utföra ytterligare reaktioner måste AMP i enzymets aktiva plats fyllas på av ATP.,
här är varför vi utför DNA-ligering vid låga temperaturer kan hjälpa
DNA-ligasenzymet har optimal aktivitet vid 25°C så ligeringsreaktionen utförs vid en temperatur som är en avvägning mellan de optimala temperaturerna för att få DNA-ändarna samman (1 ° C) och den enzymatiska reaktionen (25°C). Normalt 1H vid 16 ° C är bra men eftersom att föra DNA slutar tillsammans är den minst effektiva delen av reaktionen gynnar detta genom att sänka temperaturen till 4 ° C kan ge ännu mer effektivitet. Enzymet kommer dock att fungera mycket långsamt vid denna temperatur så länge (t. ex., över natten) inkubationstid krävs.
ursprungligen publicerad den 31 oktober 2007; uppdaterad och publicerad den 5 December 2014.
har detta hjälpt dig? Vänligen dela med ditt nätverk.
