diskussion
Gram stain är den mest använda färgningsproceduren i bakteriologi. Det kallas en differentiell fläck eftersom den skiljer mellan Gram-positiva och Gram-negativa bakterier. Bakterier som färgar lila med Gram-färgningsproceduren kallas Gram-positiva; de som fläckar rosa sägs vara Gram-negativa. Termerna positiva och negativa har ingenting att göra med elektrisk laddning, men betecknar helt enkelt två distinkta morfologiska grupper av bakterier.,
grampositiva och gramnegativa bakterier fläckar annorlunda på grund av grundläggande skillnader i cellväggarnas struktur. Bakteriecellväggen tjänar till att ge organismen dess storlek och form samt för att förhindra osmotisk Lys. Materialet i bakteriecellväggen som ger styvhet är peptidoglykan.
i elektronmikrografer framträder den grampositiva cellväggen som en bred, tät vägg 20-80 nm tjock och består av många sammankopplande lager av peptidoglykan (figurerna 1A och 1B). Kemiskt är 60 till 90% av den grampositiva cellväggen peptidoglykan., Sammanvävda i cellväggen av Gram-positiva är teichoesyror. Teichoesyror, som sträcker sig genom och bortom resten av cellväggen, består av polymerer av glycerol, fosfater och sockeralkoholen ribitol. Vissa har en lipid fäst (lipoteichoic syra). Den yttre ytan av peptidoglykan är studerad med proteiner som skiljer sig från bakteriens stam och Art.,
den gramnegativa cellväggen innehåller å andra sidan endast 2-3 lager av peptidoglykan och omges av ett yttre membran bestående av fosfolipider, lipopolysackarid, lipoprotein och proteiner (figurerna 2A och 2B). Endast 10%-20% av den gramnegativa cellväggen är peptidoglykan. Fosfolipiderna ligger huvudsakligen i det inre skiktet av det yttre membranet, liksom lipoproteinerna som förbinder det yttre membranet med peptidoglykan., Lipopolysackariderna, som ligger i det yttre skiktet av det yttre membranet, består av en lipiddel som kallas lipid A inbäddad i membranet och en polysackariddel som sträcker sig utåt från bakterieytan. Det yttre membranet innehåller också ett antal proteiner som skiljer sig från bakteriens stam och Art.,
För ytterligare information om den gramnegativa och grampositiva cellväggen, se följande Inlärningsobjekt i din Föreläsningsguide:
- den prokaryotiska cellväggen; enhet 1, avsnitt IIB2
- den grampositiva cellväggen; enhet 1, avsnitt IIB2a
- den gramnegativa cellväggen; enhet 1, avsnitt IIB2b
Gramfärgningsproceduren omfattar fyra grundläggande steg:
1. Bakterierna färgas först med grundfärgen crystal violet. Både Gram-positiva och Gram-negativa bakterier blir direkt färgade och visas lila efter detta steg.,
2. Bakterierna behandlas sedan med grams jodlösning. Detta gör att fläcken kan behållas bättre genom att bilda ett olösligt kristallviolettjodkomplex. Både Gram-positiva och Gram-negativa bakterier förblir lila efter detta steg.
3. Grams avfärgningsmedel, en blandning av etylalkohol och aceton, tillsätts sedan. Detta är differentialsteget. Grampositiva bakterier behåller kristallviolettjodkomplexet medan gramnegativa avkoloriseras.
4. Slutligen appliceras motstången safranin (även ett grundläggande färgämne)., Eftersom de Gram-positiva bakterierna redan är färgade lila, påverkas de inte av motparten. Gramnegativa bakterier, som nu är färglösa, blir direkt färgade av safranin. Således visas Gram-positiva lila, och Gram-negativa visas rosa.
© Daniel Cavanaugh, Mark Keen, författare, licensierad för användning, ASM MicrobeLibrary.,
med den nuvarande teorin bakom Gram-färgning antas det att kristallviolett och jod i Gram-positiva bakterier kombineras för att bilda en större molekyl som utfälls ut i cellen. Alkohol / acetonblandningen orsakar sedan uttorkning av den flerskiktade peptidoglykanen, vilket minskar utrymmet mellan molekylerna och orsakar cellväggen att fånga kristallviolettjodkomplexet i cellen., När det gäller gramnegativa bakterier löser alkohol/acetonblandningen, som är ett lipidlösningsmedel, cellväggens yttre membran och kan också skada det cytoplasmiska membranet som peptidoglykan är fäst vid. De få skikten av peptidoglykan kan inte behålla kristallviolettjodkomplexet och cellen är avkoloriserad.
det är viktigt att notera att Gram-positivitet (förmågan att behålla det lila kristallviolettjodkomplexet) inte är ett allt-eller-inget fenomen utan en fråga om grad., Det finns flera faktorer som kan resultera i en Gram-positiv organism färgning Gram-negativt:
1. Den metod och tekniker som används. Överhettning under värmefixering, över avfärgning med alkohol och även för mycket tvättning med vatten mellan steg kan leda till att Gram-positiva bakterier förlorar kristallviolettjodkomplexet.
2. Kulturens ålder. Kulturer som är mer än 24 timmar gamla kan förlora sin förmåga att behålla kristallviolettjodkomplexet.
3. Organismen själv., Vissa grampositiva bakterier kan behålla kristallviolettjodkomplexet än andra.
därför måste man använda mycket exakta tekniker vid Gramfärgning och tolka resultaten efter eget gottfinnande.
Trypticas Sojaagarplattkulturer av Escherichia coli (en liten, gramnegativ bacillus) och Staphylococcus epidermidis (en Gram-positiv coccus med ett staphylococcus arrangemang).
procedur (görs individuellt)
1., Escherichia coli
a. Heat-fix ett cellprov av Escherichia coli enligt följande:
1. Använd droppflaskan med avjoniserat vatten som finns i ditt färgställ, placera 1/2 av en normalstor droppe vatten på en ren glid genom att röra droppen på gliden (Figur 1). Altenately, Använd din steriliserade inokulerande slinga för att placera en droppe avjoniserat vatten på bilden.
2., Använd din sterila inokuleringsslinga och avlägsna aseptiskt en liten mängd av kulturen från agarytan och rör den försiktigt 2-3 gånger till vattendroppen tills vattnet blir synligt grumligt (Figur 2). Ett bra smet med rätt mängd bakterier är viktigt för Gram-färgning.
- alltför många bakterier på bilden kan resultera i under-avfärgning; för få kan leda till över-avfärgning.
3. Förbränna de återstående bakterierna på inokuleringsslingan., Om för mycket kultur läggs till vattnet ser du inte färgade enskilda bakterier och du kanske inte har en pålitlig Gram-fläck.
4. Efter att inokuleringsslingan svalnat, sprida suspensionen över ungefär hälften av gliden för att bilda en tunn film. Ett korrekt förberedt smet med rätt mängd bakterier ska se ut som Fig. 3.
5. Låt denna tunna suspension helt lufttorka (Figur 4). Smeten måste vara helt torr innan gliden är värme fixerad!
6., För att värma-fäst bakterierna på gliden, plocka upp den lufttorkade gliden med täckslippincett och håll botten av gliden mittemot smeten nära öppningen av mikroincineratorn i 10 sekunder (Figur 5) som visas av din instruktör. Om bilden inte värms tillräckligt, kommer alla bakterier att tvätta bort. Om den är överhettad kan bakteriens strukturella integritet skadas.
b. fläck med Huckers kristallviolett i en minut (Figur 6). Tvätta försiktigt med vatten (Figur 7). Skaka av överflödigt vatten men torka inte torrt mellan stegen.
c., Fläck med grams jodlösning i en minut (figur 8) och tvätta försiktigt med vatten.
d.Avkolorisera genom att plocka upp bilden och låta Gramets avkoloriserare springa ner bilden tills den lila bara slutar flöda längst ner på bilden (Figur 9).
- se till att hela smeten är jämnt decolorized och att du inte är under-decolorizing eller över-decolorizing.
- tvätta omedelbart med vatten.
e. fläck med safranin i en minut (Figur 10)., När du tvättar bort överskottet safranin, vara mycket noga med att tvätta försiktigt och kort eftersom det är möjligt att tvätta ut en del av sarfanin i bakterien.
f. Blot torr (Figur 11) och observera med hjälp av oljedimmersionsmikroskopi.
2. Staphylococcus epidermidis
a. Heat-fix ett smet av Staphylococcus epidermidis enligt följande:
1. Använd droppflaskan med avjoniserat vatten som finns i ditt färgställ, placera 1/2 av en normalstor droppe vatten på en ren glid genom att röra droppen på gliden (Figur 1)., Altenately, Använd din steriliserade inokulerande slinga för att placera en droppe avjoniserat vatten på bilden.
2. Använd din sterila inokuleringsslinga och avlägsna aseptiskt en liten mängd av kulturen från agarytan och rör den försiktigt 2-3 gånger till vattendroppen tills vattnet blir synligt grumligt (Figur 2).
- alltför många bakterier på bilden kan resultera i under-avfärgning; för få kan leda till över-avfärgning.
3. Förbränna de återstående bakterierna på inokuleringsslingan., Om för mycket kultur läggs till vattnet ser du inte färgade enskilda bakterier och du kanske inte har en pålitlig Gram-fläck.
4. Efter att inokuleringsslingan svalnat, sprida suspensionen över ungefär hälften av gliden för att bilda en tunn film (Figur 3).
5. Låt denna tunna suspension helt lufttorka (Figur 4). Smeten måste vara helt torr innan gliden är värme fixerad!
6., För att värma-fäst bakterierna på gliden, plocka upp den lufttorkade gliden med täckslippincett och håll botten av gliden mittemot smeten nära öppningen av mikroincineratorn i 10 sekunder (Figur 5) som visas av din instruktör. Om bilden inte värms tillräckligt, kommer alla bakterier att tvätta bort. Om den är överhettad kan bakteriens strukturella integritet skadas.
b. fläck med Huckers kristallviolett i en minut (Figur 6). Tvätta försiktigt med vatten (Figur 7). Skaka av överflödigt vatten men torka inte torrt mellan stegen.
c., Fläck med grams jodlösning i en minut (figur 8) och tvätta försiktigt med vatten.
d.Avkolorisera genom att plocka upp bilden och låta Gramets avkoloriserare springa ner bilden tills den lila bara slutar flöda längst ner på bilden (Figur 9).
- se till att hela smeten är jämnt decolorized och att du inte är under-decolorizing eller över-decolorizing.
- tvätta omedelbart med vatten.
e. fläck med safranin i en minut (Figur 10)., När du tvättar bort överskottet safranin, vara mycket noga med att tvätta försiktigt och kort eftersom det är möjligt att tvätta ut en del av sarfanin i bakterien.
f. torka och observera med hjälp av oljedimmersionsmikroskopi.
3. Se till att du försiktigt häller det använda färgämnet i färgfacket i behållaren för uppsamling av avfallsfärg, inte ner i diskbänken.
© Hussein Shoeb, författare. Licensierad för användning, ASM MicrobeLibrary.
B., KAPSELFLÄCKEN
diskussion
många bakterier utsöndrar en slemmig, viskös beläggning som kallas en kapsel eller glycocalyx . Detta består vanligtvis av polysackarid, polypeptid eller båda.
förmågan att producera en kapsel är en ärftlig egenskap hos organismen, men kapseln är inte en absolut nödvändig cellulär komponent. Kapslar produceras ofta endast under specifika tillväxtförhållanden. Även om det inte är nödvändigt för livet, hjälper kapslar säkert bakterier att överleva i naturen., Kapslar hjälper många patogena och normala florabakterier att initialt motstå fagocytos av värdens fagocytiska celler. I jord och vatten hjälper kapslar till att förhindra att bakterier uppslukas av protozoer. Kapslar hjälper också många bakterier att hålla sig vid ytor och därmed motstå spolning. Det gör det också möjligt för många bakterier att bilda biofilmer. En biofilm består av lager av bakteriepopulationer som ansluter sig till värdceller och inbäddade i en gemensam kapselmassa.,
För ytterligare information om bakteriekapslarna, se följande Inlärningsobjekt i din Föreläsningsguide:
- Glycocalyx (kapsel) och s-Layer; Unit 1, avsnitt IIB4a
- förmågan att motstå fagocytisk Engulfment; Unit 3, avsnitt B5b
ORGANISM
Skummjölksbuljong kultur Enterobacter aerogenes. Skummjölken levererar viktiga näringsämnen för kapselproduktion och ger också en något fläckbar bakgrund.
procedur (ska göras individuellt)
1., Rör upp Skummjölksbuljongkulturen med din slinga och placera 2-3 slingor Enterobacter aerogenes på en mikroskopskiva.
2. Använd din inokulerande slinga, sprida provet ut för att täcka ungefär en tum av bilden.
3. Låt det helt lufttorka. Värm inte fix. Kapslar håller sig väl till glas, och värme kan förstöra kapseln.
4. Fläck med kristallviolett i en minut.
5. Tvätta bort det överflödiga färgämnet med 20% kopparsulfatlösning.
6. Skaka av överskott av kopparsulfatlösning och torka omedelbart.
7. Observera med hjälp av oljedimmersionsmikroskopi., Organismen och mjölken som torkas på bilden kommer att hämta det lila färgämnet medan kapseln kommer att förbli färglös.
8. Se till att du försiktigt häller det använda färgämnet i färgfacket i behållaren för uppsamling av avfallsfärg, inte ner i diskbänken.
9. Observera demonstrationskapselfläcken av Streptococcus lactis , en inkapslad bakterie som är normal flora i mjölk.
A. gramfläcken
gör ritningar av varje bakterie på din Gram-fläckberedning.,
|
|
|
| Color = Gram reaction = Shape = |
Color = Gram reaction = Shape = Arrangement = |
B., Kapselfläcken
gör en ritning av din kapselfläckberedning av Enterobacter aerogenes och demonstrationskapselfläcken av Streptococcus pneumoniae.
Kapselfläck av
Streptococcus lactis
