upptäckt av mitokondriellt DNA
vissa begrepp tar den vetenskapliga världen med storm, men andra erövrar det först efter många skirmishes. Upptäckten av mitokondriellt DNA (mtDNA) tillhör denna andra kategori. Biokemister, histologer och elektronmikroskopister hade sett DNA i mitokondrier i flera år, men de flesta var inte redo för tanken att DNA verkligen tillhörde där. Detta kan förklara varför lärobok konton mtDNA nästan aldrig berätta hur detta DNA upptäcktes.,
Efter att den grundläggande byggplanen för eukaryota cellen hade avslöjats i början av 1950-talet av elektronmikrograferna Palade, Sjöstrand och andra, omfamnade biokemister de Duves dogma att varje makromolekyl hade en och endast en intracellulär plats. I analysen av cellfraktioner togs cytokrom oxidas som en markör för mitokondrier, nicotianamidadenindinukleotidfosfat (NADPH) – cytokrom C-reduktas för endoplasmatisk retikulum och DNA för kärnan., Med tanke på denna sinnesstämning är det lätt att förstå varför närvaron av DNA i mitokondriella fraktioner i allmänhet hänfördes till förorening av kärnfragment. Histokemiska DNA-fläckar, såsom Feulgenreaktionen, färgade också Kinetoplasterna av trypanosomer och ”nebenkern” av insektsspermatozoa, men vid den tiden var det ännu inte erkänt att dessa strukturer faktiskt var ovanliga mitokondrier., Massiva mängder extranukleärt DNA detekterades också i cytoplasman hos amfibiska oocyter, men det tog många år att inse att detta DNA faktiskt var mtDNA vars överflöd återspeglade den enorma mängden mitokondrier i dessa stora celler. 1961, vid den Femte Årliga Mötet för American Society of Cell Biology i Chicago, Hans Ris visade electron micrographs mitokondrier med inneslutningar som liknar DNA-innehållande nucleoids av bakterier och gjorde den kätterska förslag som mitokondrier och kloroplaster) innehåller sina egna DNA., I ett papper som dök upp under det följande året dokumenterade Ris och Walter s Plaut dessa observationer ytterligare och utvidgade dem. Snart därefter bekräftade biokemiska och morfologiska bevis från flera grupper närvaron av DNA i kloroplaster.
upptäckten av kloroplast DNA biokemister ta en ny titt på tidiga iakttagelser av Margaret Mitchell och Boris Ephrussi att vissa mutationer som påverkar mitokondriernas funktion i formen Neurospora crassa och jästen Saccharomyces cerevisiae var inte ärvs enligt Mendels lagar., Det verkade frestande att spekulera om att de okända ”extrakromosomala faktorerna” som var inblandade i dessa mutationer faktiskt var mtDNA.
år 1962 var grunden för begreppet mtDNA således väl förberedd, men själva konceptet var inte allmänt accepterat. I efterhand verkar det som om det vetenskapliga samfundet väntade på övertygande studier som dokumenterade förekomsten av mtDNA med flera olika metoder.
en av dessa studier kom från elektronmikroskoperna Margit MK Nass och Sylvan Nass, som sedan arbetade vid Wenner Gren-institutet vid Stockholms universitet., De visade att matrisen av osmium-fixerade kycklingembryo mitokondrier innehöll gängliknande inklusioner vars utseende efter olika fixeringsförfaranden nära parallell med den histonfria DNA-nukleoiden av bakterier: efter fixering med osmiumtetroxid uppträdde inklusionerna klumpade och som barer med en diameter av ~400 Å; fixering av vävnaderna med osmiumtetroxid följt av behandling med uranylacetat före uttorkning fick dem att framstå som 15-30-Å tunna fibrer., Ännu mer övertygande bevis för närvaron av DNA i dessa inklusioner var observationen att inklusionerna kunde avlägsnas genom att behandla den lätt fixerade embryonala vävnaden med DNas. Behandling med pepsin, med RNase eller med DNase-fria buffertkontroller var ineffektiv. Tydligheten hos dessa elektronmikrografer och de noggranna kontroller som inkluderades hade en övertygande inverkan på cellbiologer. MMK Nass och S Nass publicerade sitt arbete i två back-to-back-papper i ett 1963 numret av Journal of Cell Biology., Vid den tiden var cellbiologi och biokemi fortfarande ganska olika discipliner och de flesta biokemister läste inte tidskrifter som ägnades åt cellbiologi. Det tog därför ett tag innan resultaten av MMK Nass och S Nass gick in i medvetandet hos det biokemiska samhället.
vid ungefär samma tid försökte Ellen Haslbrunner, Hans Tuppy och Schatz vid Biochemistry Institute of the University of Vienna att hitta en biokemisk grund för extrakromosomala mutationer som avskaffade andningsfunktionen i jästen S. cerevisiae., I början av 1960-talet var många biokemister fortfarande ovilliga att överväga ”respiratoriska granuler” av jäst som bona fide mitokondrier, som placerade forskningen av Haslbrunner et al. väl utanför mainstream av mitokondriell biokemi i USA och på andra håll.
för att leta efter DNA i mitokondrier valdes ett biokemiskt tillvägagångssätt. Jäst mitokondrier renades med de bästa tillgängliga metoderna, och deras DNA-innehåll mättes av den tidskrävda ”Diesche” färgreaktionen., Några år tidigare hade de Duve och medarbetare visat att centrifugering av subcellulära fraktioner till jämvikt i en täthetsgradient ofta gav en ren separation av olika organeller. Överraskande, de vanliga sackaros gradienter separerade inte jäst mitokondrier från kärnfragment, men när sackaros ersattes med röntgenkontrastmedel ”Urografin”, mitokondrier bildade en extremt skarp band, och DNA var närvarande i endast två fraktioner: de flesta var på botten av centrifugröret, och en mycket liten mängd, men diskret topp sammanföll exakt med den hos mitokondrier., DNA i bottenfraktionen smältes lätt av DNase och representerade tydligen nukleärt DNA. DNA i den mitokondriella fraktionen smältes inte lätt av DNas om inte organellerna först stördes med triklorättiksyra; förmodligen representerade det DNA som omsluts av mitokondriella membran. Dess koncentration var mycket konstant mellan olika experiment−mellan 1 och 4 µg mg-1 mitokondriellt protein. Urografin-renade mitokondrier från råttlever, rått njure och bovint hjärta – innehöll nästan 10 gånger mindre DNA, mellan 0.2 och 0.6 µg DNA per mg protein., Den typiska mitokondrionen hos däggdjur beräknades innehålla 3 × 10-17 g DNA. Förutsatt att DNA var dubbelsträngat, kunde det koda inte mer än 1.2 MDa av polypeptidkedjor. Detta resultat ansågs viktigt, eftersom det starkt utesluter möjligheten att mtDNA kodade alla mitokondriella proteiner. Idag, denna tidiga beräkning av Haslbrunner et al. kan utmanas på flera grunder, men det kom anmärkningsvärt nära verkligheten: de 13 polypeptiderna kodade av däggdjursmtdna har en total massa på 0.,423 MDa, och återstoden av kodningspotentialen är till stor del redovisas av gener för ribosomal och överföring rna, liksom av det faktum att mitokondrier vanligtvis har mer än en kopia av deras DNA genom.
